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논문 기본 정보
- 자료유형
- 학술저널
- 저자정보
- 발행연도
- 2013.1
- 수록면
- 17 - 25 (9page)
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메탄올 자화효모 Hansenula polymorpha에서 분비 발현이잘 된다고 보고된 인체 혈청 알부민(human serum albumin,HSA)을 융합단편으로 사용하여 외래 재조합 단백질을 효과적으로 분비 발현할 수 있는 발현시스템을 개발하고자 하였다. 이때 조작의 용이성 및 발현 효율 제고를 위하여 전장의HSA 뿐만 아니라 세 종류의 각기 다른 크기의 HSA 단편을설계하여 융합단편으로 사용하였다. 즉 HSA의 N-말단으로부터 각기 137, 172, 320, 608개 아미노산을 갖는 융합단편HSAft (1-4)를 제작하였다. 아울러 발현되는 HSA 단편의 검출 및 분리정제를 위한 His8-tag, HSA 융합단편과 외래 단백질간의 유연성을 부여하기 위한 2조의 Gly4Ser1 linker, 융합 발현된 타겟 단백질을 HSA 단편으로부터 용이하게 분리하기 위한 담배식각바이러스 단백질분해효소(tobacco etch virus protease, Tev) 인지 서열, 타겟 단백질 유전자를 클로닝하기 위한 멀티 클로닝 사이트(multiple cloning site,MCS)서열, 그리고 타겟 재조합 단백질의 발현 검출 및 정제를 위한 Strep-tag을 포함하는 작용기 도메인을 발현카세트기본 골격에 포함시켰다. 이렇게 구축된 4종의 HSA 융합단편 분비발현 벡터를 H. polymorpha에 형질전환한 후 각 융합단편의 발현을 조사한 결과 HSAft 단편 3, 4의 발현을 확인할 수 있었다. 녹색형광단백질 유전자 (GFPuv)를 상기 벡터에 클로닝한 후 H. polymorpha에 도입한 결과 형질 전환체 모두에서 녹색형광단백질의 발현을 관찰 할 수 있었다.
해당 세포로부터 분비되거나 세포내에 발현되는 HSA 단편융합 형광단백질의 발현양을 비교한 결과 HSAft 단편 4에융합된 경우를 제외하고 나머지 경우 모두에서 세포 파쇄액과 세포 배양액 양쪽에서 해당 HSA 단편 융합 형광단백질의 발현을 확인 할 수 있었다. 한편 HSA 융합단편의 크기에따라 자체 혹은 타겟 단백질과 융합된 형태의 단백질 분비발현 정도가 달라지는 것은 해당 단백질의 접힘이나 단백질분해효소에 대한 민감성 등 여러 변수에 의한 것으로 사료되며 따라서 본 연구에서 개발한 H. polymorpha용 HSA 융합단편 분비발현 시스템은 특정 외래 재조합 단백질의 효율적인 분비발현 융합단편의 선별 및 과발현 시스템 구축에 유용하게 활용될 수 있을 것으로 기대된다.
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참고문헌 (24)
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Agaphonov, M. O. / 1999 / Vectors for rapid selection of integrants with different plasmid copy numbers in the yeast Hansenula polymorpha DL1 / Yeast 15 : 541 ~ 551
Bradford, M. M. / 1976 / A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding / Anal. Biochem 7
Buckholz, R. G. / 1991 / Yeast systems for the commercial production of heterologous proteins / Biotechnology 9 : 1067 ~ 1072
Carlson, M. / 1987 / Regulation of sugar utilization in Saccharomyces species / J. Bacteriol 169 : 4873 ~ 4877
Chow, T. Y. / 1992 / Screening and identification of a gene, PSE-1, that affects protein secretion in Saccharomyces cerevisiae / J. Cell. Sci 101 : 709 ~ 719
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Chow, T. Y. / 1992 / Screening and identification of a gene, PSE-1, that affects protein secretion in Saccharomyces cerevisiae / J. Cell. Sci 101 : 709 ~ 719
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