선체부착생물 수중청소 배출수 내 부착조류 생사판별을 위한 ATP assay 방법 개발

차형곤; 신경순; 장민철; 장풍국; 최근형; 현봉길

doi:10.7846/JKOSMEE.2023.26.4.359

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자료유형: 학술저널

저자정보: 차형곤 (한국해양과학기술원) 신경순 (한국해양과학기술원) 장민철 (한국해양과학기술원) 장풍국 (한국해양과학기술원) 최근형 (충남대학교) 현봉길 (한국해양과학기술원)

저널정보: 한국해양환경·에너지학회 한국해양환경·에너지학회지 한국해양환경·에너지학회지 제26권 제4호

발행연도: 2023.11

수록면: 359 - 366 (8page)

DOI: 10.7846/JKOSMEE.2023.26.4.359

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선체 수중청소 과정에서 방오도료 부산물과 함께 배출되는 ≥10 and <50 μm 크기 부착조류의 생사판별을 위해서, 세포의 개체수 및 크기에 따라 발광 세기를 정량화하는 ATP assay 방법 적용 가능성에 대해 확인해 보고자 하였다. 선체부착생물 수중청소 배출수 시료는 직접 한국해양과학기술원 연구선과 컨테이너 선박 수중 청소를 통해 획득하였으며, 실험 전 <5 μm mesh를 이용해서 크기가 큰 부유물질을 제거한 다음 모두 멸균 처리하였다. 녹조류인 Tetraselmis suecica와 부착규조류 Navicula sp., Halamphora coffeaeformis, Halamphora veneta 3종을 실험종으로 선정하였으며, 실험구의 개채수 농도 구배는 T. suecica는 0, 5, 10, 25, 50 cells mL-1, Navicula sp., Halamphora coffeaeformis, Halamphora veneta는 0, 50, 100, 500, 1,000 cells mL<SUP>-1</SUP>가 되도록 각각 연구선과 컨테이너 선박 수중 청소 배출수 시료에 주입하였다. 개체수 농도 구배에 따른 생물발광(Bioluminescence, RLU) 값과 FDA+CMFDA 염색 결과, 그리고 세포 부피 분석 결과를 비교해서 세포 크기에 따른 RLU 값을 산정하였다. 또한, 수중청소 배출수 부산물에 대한 발광 간섭효과를 확인하기 위해 3종의 부착 규조류들을 선체부착생물 수중청소 전 선박 주변수에 주입하여 RLU 값을 측정하였다. 수중 청소 배출수 조건에서 T. suecia 및 부착 조류 3종의 RLU 값은 생물농도에 따라 선형성을 보였지만(R2=0.942~0.999, p<0.05), 수중청소 배출수 부산물은 Luciferase 효소의 발광 강도에 영향을 미치는 것으로 확인되었다(pooled variance t-test, p<0.05). 본 연구는 선체부착조류의 작은 크기와 응집으로 인한 형광현미경을 활용한 염색 방법의 적용 한계에 따른 대안 연구로 진행되었다. 본 연구에서 선체부착 수중청소 부산물 시료의 간섭효과는 확인되었지만, 생물 밀도에 따른 선형성도 또한 확인되어 향후 추가적인 보완 연구가 진행된다면 선체부착생물 수중청소 ≥10 and <50 μm 크기 부착조류의 생사판별 방법으로 적용 가능할 것으로 판단된다.

This study investigated the feasibility of applying the ATP assay method to quantify the luminescence (RLU) intensity based on cell density and size for the live/dead determination of attached microalgae (≥10 and <50 μm) discharged with antifouling biocide particles during the in-water cleaning process. Wastewater samples were obtained from an R/V and container vessel through the in-water cleaning process. Before the experiments, larger particulate debris was removed using a <5 μm mesh before being sterilized. Tetraselmis suecica and the attached diatoms Navicula sp., Halamphora coffeaeformis, and Halamphora veneta were selected as test species. T suecica was inoculated into the wastewater sampled from the R/V vessel at final concentrations of 0, 5, 10, 25, and 50 cells mL<SUP>-1</SUP>, while the diatom species were inoculated into the wastewater at final concentrations of 0, 50, 100, 500, and 1,000 cells mL-1. The RLU values, FDA+CMFDA staining, and cell volume analysis results were compared to determine RLU values based on cell size. Additionally, to understand the interference effect of in-water cleaning wastewater on RLU values, the diatom species were inoculated into the ambient water of the container vessel, and RLU values were measured. The RLU values of T. suecica and the diatom species exposed to the in-water cleaning wastewater showed a linear relationship with cell density gradient (R2=0.942-0.999, p<0.05). However, the wastewater was also seen to affect the luciferase reaction rate and RLU intensity (pooled variance t-test, p<0.05). This study is being conducted as alternative research because the fluorescence microscopy staining method is limited by the small size and aggregation of attached diatoms to the vessel’s hull. Our study results suggest that the ATP assay method can be applied to future research on the live/dead determination of attached diatoms in the inwater cleaning wastewater.

#ATP assay(ATP 측정법) #Attached microalgae(부착조류) #In-water cleaning(수중청소) #Live/Dead determination(생사판별)

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