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논문 기본 정보
- 자료유형
- 학위논문
- 저자정보
- 지도교수
- 김두환
- 발행연도
- 2013
- 저작권
- 건국대학교 논문은 저작권에 의해 보호받습니다.
이용수4
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본 연구는 대표저인 생명공학기술인 Agrobacterium-매개법과 Particle bombardment을 이용하여 환경복합저항성 유전자와 노화 방지 유전자가 도입된 Cymbidium을 생상 체계 확립을 위해 수행되었다.
실험 재료로는 Cymbidium 육종 계통인 융플라워X마사코를 이용하였으며, 유전자는 환경복합저항성 유전자 (AtSIZ)가 도입된 pNB96 vector를 이용하였다.
PLB의 증식 및 재분화 효율을 높이기 위한 방법으로 LED 광원별 (적색, 청색, 적색 및 청색 혼합광, 형광등) 실험을 실시하였다. 그 결과 적색과 청색에서 PLB증식효율이 비교적 높았으나, 적색에서 PLB의 색이 옅어지는 것을 관찰하였고, 적색 및 청색 혼합광에서 재분화 효율이 가장 높게 나타났다.
형질전환 실험 시 선발제로 이용되는 DL-phosphinothricin (PPT)를 대신하여 선발 효과와 비용절감 효과를 얻기 위해 수행한 Basta선발 실험에서, 20 mg/l PPT와 0.01 % (v/v) Basta첨가 시 동일한 PLB 고사 수준을 보여 PPT를 대체 한 선발제로 Basta를 사용할 수 있을 것으로 나타났다.
Agrobacterium매개법의 효율을 높이기 위한 실험에서는 OD600값별 (0.5, 1.0, 1.5), 선발지연기간별 (0, 1, 2, 3, 4주) 실험을 수행하였으며, 1.0과 4주 일 때 가장 형질전환 효율이 높았다. Particle bombardment에서는 bombardment전 삼투압 처리 (0.4 M manitol, 0.4 M sorbitol, 0.4 M sucrose, 무처리)에서는 무처리구가, 선발지연기간 (0, 1, 2, 3, 4 주)은 4주, bombardment 횟수 (1, 2, 3, 4 회)는 2회 처리한 실험구에서 형질전환 효율이 높게 나타났다.
본 실험을 통해 얻어진 형질전환 심비디움은 PCR을 통해 bar유전자의 도입을 확인하였다. 환경복합저항성 유전자의 기능성을 검정하기 위해 실시한 내염성, 내건성 및 제초제 저항성 실험에서 유전자를 가진 심비디움 형질전환체가 비형질전환체보다 장기간 녹색을 유지하며 살아남아 유전자가 발현하고 있음을 확인하였다.
실험 재료로는 Cymbidium 육종 계통인 융플라워X마사코를 이용하였으며, 유전자는 환경복합저항성 유전자 (AtSIZ)가 도입된 pNB96 vector를 이용하였다.
PLB의 증식 및 재분화 효율을 높이기 위한 방법으로 LED 광원별 (적색, 청색, 적색 및 청색 혼합광, 형광등) 실험을 실시하였다. 그 결과 적색과 청색에서 PLB증식효율이 비교적 높았으나, 적색에서 PLB의 색이 옅어지는 것을 관찰하였고, 적색 및 청색 혼합광에서 재분화 효율이 가장 높게 나타났다.
형질전환 실험 시 선발제로 이용되는 DL-phosphinothricin (PPT)를 대신하여 선발 효과와 비용절감 효과를 얻기 위해 수행한 Basta선발 실험에서, 20 mg/l PPT와 0.01 % (v/v) Basta첨가 시 동일한 PLB 고사 수준을 보여 PPT를 대체 한 선발제로 Basta를 사용할 수 있을 것으로 나타났다.
Agrobacterium매개법의 효율을 높이기 위한 실험에서는 OD600값별 (0.5, 1.0, 1.5), 선발지연기간별 (0, 1, 2, 3, 4주) 실험을 수행하였으며, 1.0과 4주 일 때 가장 형질전환 효율이 높았다. Particle bombardment에서는 bombardment전 삼투압 처리 (0.4 M manitol, 0.4 M sorbitol, 0.4 M sucrose, 무처리)에서는 무처리구가, 선발지연기간 (0, 1, 2, 3, 4 주)은 4주, bombardment 횟수 (1, 2, 3, 4 회)는 2회 처리한 실험구에서 형질전환 효율이 높게 나타났다.
본 실험을 통해 얻어진 형질전환 심비디움은 PCR을 통해 bar유전자의 도입을 확인하였다. 환경복합저항성 유전자의 기능성을 검정하기 위해 실시한 내염성, 내건성 및 제초제 저항성 실험에서 유전자를 가진 심비디움 형질전환체가 비형질전환체보다 장기간 녹색을 유지하며 살아남아 유전자가 발현하고 있음을 확인하였다.
목차
Ⅰ. Introduction 11. Important of orchid and the production 11) The importants of orchid 12) Orchid growing status in Korea 12. Plant breeding of Orchidaceae 31) Hybridization and plant tissue culture 32) Transformation 3(1) Agrobacterium tumefaciens 3(2) Particle bombardment 43. Background 5Ⅱ. Materials and methods 81. Plant tissue culture 81) Plant material and culture condition 82) Effect of LEDs on PLBs propagation and plantlet formation 82. Transformation 91) Comparison of selection marker 92) Agrobacterium tumefaciens 9(1) Agrobacterium tumefaciens strains and plasmid 9(2) Inoculation and cocultivation with Agrobacterium 9① Effect of concentration of Agrobacterium tumefaciens 10② Effect of delay before transfer to selection medium in Agrobacterium tumefaciens 103) Particle bombardment 10(1) Preparation of plasmid DNA 10(2) Preparation of bombardment 11① Effect of osmotic pre-treatment on particle bombardment in Cymbidium PLBs 11② Effect of varying number of shots per bombardment 12③ Effect of delay before transfer to selection medium in particle bombardment 124) Transgenic plants regeneration 123. Hardening of plantlet 144. Molecular biological analysis 141) DNA isolation 142) PCR analysis 145. Analysis of transgene expression 151) Expression of bar gene in transgenic Cymbidium 152) Effect of salt tolerance on transgenic Cymbidium 153) Effect of drought tolerance on transgenic Cymbidium 156. Statistical analysis 16Ⅲ. Results and discussion 171. Effect of LEDs on PLBs propagation and plantlet formation 172. Transformation 191) Comparisons of Selection marker 192) Agrobacterium tumefaciens 21(1) Effect of Agrobacterium tumefaciens concentration 21(2) Effect of delay before transfer to selection medium in Agrobacterium tumefaciens 233) Particle bombardment 25(1) Effect of osmotic pre-treatment on particle bombardment in Cymbidium PLBs 25(2) Effect of Shooting number of particle bombardment 27(3) Effect of delay before transfer to selection medium in particle bombardment 283. Molecular analysis 294. Analysis of transgene expression 301) Bar gene functional test 302) AtSIZ gene functional test 31(1) Effect of salt stress tolerance gene on transgenic Cymbidium 32(2) Drought tolerance test with transgenic Cymbidium plants 335. Conclusion 34References 36Abstract (In Korean) 44
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