고분자-단백질 하이브리드 나노구조체는 제약 및 생체기술 분야에서 잠재적인 응용성을 가지며 위 분야에서 유리한 하이브리드 구조체를 생성하는 새로운 방법이므로 중요한 의미를 가진다. 여기에서 말단 작용기로 니켈이 콤플렉스 된 나이트릴로트리아세트산 (nitrilotriacetic acid)을 가지는 폴리스타이렌 (Ni-NTA-PS)과 히스티딘 표지 녹색 형광 단백질 (His-tagged GFP)을 물과 DMF (DMF 4 vol. %) 혼합용매에서 생리적 pH 조건하에 NTA-Ni/His 상호작용을 통하여 in situ 방법으로 구형의 고분자-단백질 하이브리드 응집체를 간단하게 구현 및 조절하는 방법을 기술하였다. 본 연구에서는 His-tagged GFP 및 리파아제를 사용하여 이 접근방법에 대한 일반성을 서술하였다. 투과 전자 현미경 (transmission electron microscopy, TEM) 및 동적광산란법 (dynamic light scattering, DLS)을 사용하여 His-tagged GFP의 하이브리드 응집체가 15일 동안 구조적 안정성을 보이는 것을 확인하였다. 하이브리드 응집체의 크기는 고분자의 분자량, 농도와 단백질의 농도 및 단백질이 존재하는 용매에 고분자를 투입하는 속도에 의존하였다. 하이브리드 응집체가 형성된 후, 계 내의 DMF를 투석하여 제거함으로써 시간에 따른 하이브리드 응집체의 응집과 상분리를 확인하였다. 고분자-단백질 하이브리드 나노구조체의 크기는 과량의 이미다졸 (imidazole)을 투입함으로써 감소하였다. 고분자-단백질 하이브리드 응집체의 형성에 대한 메커니즘 또한 기술하였다.
또한 원자 이동 라디칼 중합 (atom transfer radical polymerization, ATRP)과 “click” chemistry 기술을 사용하여 사슬 양 말단에 NTA 작용기를 가지는 폴리스타이렌 (di-NTA-PS)의 합성을 설명하였으며, 물과 DMF 혼합용매에서 di-NTA-PS와 His-tagged GFP와의 자기조립 거동을 연구하였다. 본 연구를 위하여, 먼저 α,ω-다이브로모폴리스타이렌을 고분자 사슬 말단 작용기를 쉽게 개질할 수 있는 접근법인 ATRP를 통해 다이메틸 2,6-다이브로모헵탄다이오에이트 개시제로부터 합성하였다. 친핵성 치환반응으로 고분자 사슬 α 및 ω말단에 아자이드기를 도입한 후, click coupling 반응을 통해 tert-butyl 기로 보호되어 있는 NTA부분을 붙였으며, 그 다음 tert-butyl 기를 제거하였다. 1H NMR, FT-IR 및 GPC 분석을 통해 고분자의 특성을 결정하였다. 물과 DMF 혼합용매 (DMF 4 vol. %)에서 NTA-Ni/His 과 His-tagged GFP의 상호작용으로 만들어진 고분자-단백질 하이브리드의 자기조립 거동을 연구하기 위하여, 폴리스타이렌의α,ω-NTA 작용기를 니켈과 킬레이트시켰다. 초기에 구형의 고분자-단백질 하이브리드응집체가 형성되며 시간이 지남에 따라 거대한 막대형상의 고분자-단백질 하이브리드 응집체가 생성되는 것을 TEM, 주사전자현미경 (scanning electron microscopy, SEM), 원자력간현미경 (atomic force microscopy, AFM), 및 공초점 레이저 주사현미경 (confocal laser scanning microscopy, CLSM)을 사용하여 확인하였다.
별개의 연구로, 우리는 사슬 말단에 tri-NTA를 작용기로 가지는 폴리스타이렌을 ATRP를 통해 tert-butyl 기로 보호된 NTA 부분을 가지고 있는 개시제로부터 합성하였다. 먼저, tert-butyl 기로 보호되어 있는 NTA와 활성화된 알킬 브로마이드 부분을 가지는 적합한 ATRP 개시제를 합성하였다. 개시제를1H NMR, 13C NMR, GPC 및 MALDI-TOF mass를 통해 특성결정 하였다. tri-NTA 작용기를 사슬 말단에 가지는 폴리스타이렌 (tri-NTA-PS)을 얻기 위하여 사슬말단에 위치한 NTA작용기의tert-butyl 부분을 제거하였다. tri-NTA-PS의 구조를 1H NMR and 13C NMR을 통해 분석하였다. tri-NTA-PS는 물과 THF 혼합용매 상에서 자기조립 거동을 통해 40 - 60 nm의 크기를 가지는 구형의 응집체를 형성하였으며, 니켈이 콤플렉스 된 tri-NTA-PS는 His-tagged GFP 와 함께 물/DMF (DMF 4 vol%) 상에서 NTA-Ni/His 상호작용을 통해 90 - 115 nm 직경을 가지는 구형의 코어-쉘 하이브리드 응집체를 형성하였다. 본 결과는 TEM 및 DLS 측정을 통해 확인하였다.

Polymer-protein hybrid nanostructures are important for their potential applications in pharmaceuticals and biotechnology, and new methods to generate hybrid nanostructures would be advantageous in above fields. Herein, we described a simple method for the construction and control of polymer-protein hybrid spherical aggregates in situ from nickel complexed mono-(nitrilotriacetic acid)-end-functionalized polystyrene (Ni-NTA-PS) and histidine-tagged green fluorescent protein (His-tagged GFP) through NTA-Ni/His interaction in water/DMF (DMF 4 vol %) at physiological pH. The generality of the approach was demonstrated by using His-tagged GFP and His-tagged lipases. Transmission electron microscopy (TEM) and dynamic light scattering (DLS) measurements revealed that hybrid aggregates of His-tagged GFP were stable up to 15 days. The size of hybrid aggregates depended on the molecular weight of polymers, concentration of polymers, concentration of protein, and also the rate of adding polymer to solvent, containing protein. After formation of hybrid aggregates, removal of DMF by dialysis from the system resulted in the aggregation and phase separation of aggregates over time. The size of polymer-protein hybrid aggregates decreased with excess of imidazole addition. A possible mechanism for the formation of such polymer-protein hybrid aggregates was also described.
We also demonstrated the synthesis of α,ω-di-(nitrilotriacetic acid) (NTA)-end-functionalized polystyrene ( NTA-PS-NTA) by combining atom transfer radical polymerization (ATRP) and “click” chemistry, and studied their self-assembly behavior with His-tagged proteins in water/DMF. For this, first α,ω-dibromopolystyrene was synthesized using dimethyl 2,6-dibromoheptanedioate initiator by ATRP for the facile post modification of the polymer chain-end groups. After introduction of azide groups at the chain ends of the polymer by nucleophilic substitution, tert-butyl protected NTA moieties were attached at the α,ω-chain-ends of polymer by click coupling, and subsequently tert-butyl groups were removed. The polymer was characterized by 1H NMR, FT-IR and GPC studies. α,ω-NTA chain-ends of the polystyrenes were chelated with nickel to study self-assembly behavior of polymer-protein hybrids via NTA-Ni/His interaction with His-tagged GFP in water/DMF (DMF 4 vol. %). It was observed that polymer-protein hybrid spherical aggregates were formed initially, which later over time produced giant rod like polymer-protein hybrid aggregates as was confirmed by transmission electron microscopy (TEM), scanning electron microscopy (SEM), atomic force microscopy (AFM), and confocal laser scanning microscopy (CLSM).
In a separate study, we described the synthesis of tri-(nitrilotriacetic acid) (NTA)-end-functionalized polystyrenes using an initiator containing tert-butyl protected NTA moieties by atom transfer radical polymerization (ATRP) of styrene. First, a suitable ATRP initiator containing tert-butyl protected NTA moieties and activated alkyl bromide was prepared. The initiator was characterized by 1H NMR, 13C NMR, GPC and MALDI-TOF mass spectra. The protected tert-butyl groups were subsequently removed from the α-chain end of polystyrenes to obtain deprotected tri-NTA-end-functionalized polystyrenes (tri-NTA-PS). The structure of tri-NTA-PS was characterized by 1H NMR and 13C NMR. It was found that tri-NTA-PS itself produced self-assembled spherical aggregates of ~40-60 nm diameters in water/THF, while nickel complexed tri-NTA-PS produced spherical core-shell hybrid aggregates of ~90-115 nm diameters with His-tagged GFP through NTA-Ni/His interaction in water/DMF (DMF 4 vol%) as confirmed by transmission electron microscopy (TEM) and dynamic light scattering (DLS) measurements.