친환경 선충 방제제 개발을 위해 경북 성주군 선남면 및 충남 공주군 우성면의 시설원예 재배지 토양으로부터 선충 포식성이 뛰어난 곰팡이 Arthrobotrys thaumasia Nema-1과 선충 표피성분인 collagen, gelatin, albumin 단백질 등을 분해하는 protease 생성능력이 뛰어난 Pseudomonas monteilii C-5, Bacillus subtilis C-9 과 Burkholderia stabilis SAph-24를 분리하였다. 이들 분리 균의 선충 치사효과를 실내 검정한 결과, A. thaumasia Nema-1 곰팡이 배양액 5,000 ㎕/L의 농도로 처리 시 방제가는 3일 후에 55%이었으나, 선충포식곰팡이 A. thaumasia Nema-1과 근권세균 P. monteilii C-5 배양액 각각 5,000 ㎕/L 씩 혼합 처리구에서는 65%로 상승하였다. 또한 선충 치사효과를 증진시키기 위하여 살선충 활성이 있다고 보고된 계피추출물 50 mg/L와 A. thaumasia Nema-1, P. monteilii C-5 배양액을 각각 5,000 ㎕/L의 농도로 혼합하여 처리하였을 때 3일 경과 후의 치사율은 89%로 상승되므로서, 대조구로 사용한 살선충제인 Fosthiazate(a.i. 5%) 원제농도 2.5 mg/L로 처리 시 방제가 17%와 님오일(azadiractin 0.3%) 2,000 ㎕/L로 처리 시 방제가 57% 보다 높은 수준이었다. 이들 분리 균을 대상으로 토마토 포트실험을 통해 선충 치사효과의 지표인 난낭수 감소를 검토한 결과, A. thaumasia Nema-1 곰팡이 제제 5,000 mg/kg의 농도로 처리 시 고구마뿌리혹선충의 난낭수가 무처리 대비 35% 감소하였다. 선충포식곰팡이 A. thaumasia Nema-1과 세균 B. subtilis C-9 제제를 각각 5,000 mg/kg의 농도로 혼합한 처리구에서는 난낭수가 무처리 대비 67% 감소하였다. 또한 선충 치사효과를 증진시키기 위하여 살선충 활성이 있다고 보고된 계피추출물 제제 10 mg/kg와 A. thaumasia Nema-1, B. subtilis C-9 제제를 각각 5,000 mg/kg의 농도로 혼합처리 하였을 때 난낭수가 무처리 대비 81% 감소하여 대조구인 Fosthiazate(a.i. 5%)의 표준사용 농도 1.2 mg/kg 처리 시 난낭수가 26% 감소한 결과와 비교해 볼 때 높은 수준의 방제효과를 보였다. 이상의 결과는 생물학적 선충 방제제는 미생물 또는 식물체 추출물 단제보다는 혼합물 형태로 사용하는 것이 더 효과적이라는 결과를 제시하였다. 분리세균 중 단백질 분해 활성이 가장 우수한 B. stabilis SAph-24 균주의 protease 생성 최적 배양조건을 검토하고, 배양여액으로부터 protease를 정제하여 효소적 특성을 검토하였다. 최적 배양조건은 0.7% KH2PO4, 0.2% K2HPO4, 0.01% MgSO4?7H2O, 0.05% citric acid dehydrate, 0.1% yeast extract, 0.2% casein 배지에서, 1% inoculum, 온도 40oC, 150 rpm의 조건에서 48시간 진탕 배양 시 116.4 U/mL의 최대 protease 활성을 보였다. 또한 배양여액으로 부터 정제한 protease의 분자량은 SDS-PAGE법에 의해 45 kDa로 측정되었으며, 최대 protease 활성은 pH 8, 온도는 50oC 이었고, 효소활성은 온도 40oC 이상 과 pH 9 이상에서도 안정성을 보였다. 정제효소는 Zn2+, Ni2+, Sn2+에 의해 저해되었으나 Ca2+, Mg2+, Mn2+에 의해서는 효소활성이 증진되었으며, 사용한 기질 casein, egg albumin, gelatin, BSA에 대해 casein에서 가장 높은 활성을 나타내었다. 또한 casein 기질에 대한 정제효소의 Vmax는 89.28 U/mL, Km 값은 0.82 mg/mL 이었다.

The present investigation was aimed at assessing the potential use of Arthrobotrys thaumasia Nema-1, a nematophagous fungi and Pseudomonas monteilii C-5, Bacillus subtilis C-9, and Burkholderia stabilis SAph-24 which possess the ability to degrade collagen, gelatin and albumin, as a biological nematicide. The microbes were isolated from soils collected from oriental melon fields at Kyungpook Sungju-gun, Seonnam-myun and tomato fields at Chungnam Gongju-gun, Woosung-myun in South Korea. Melodogyne incognita, a nematode was treated with 5,000 ㎕/L culture of A. thaumasia Nema-1, and the nematicidal activity was measured as 55% after 3days of the treatment. The nematicidal activity could be increased up to 65% by treating the culture mixture of 5,000 ㎕/L A. thaumasia Nema-1 and P. monteilii C-5. Addition of cinnamon extract (50 mg/L) to the mixture of 5,000 ㎕/L of A. thaumasia Nema-1 and P. monteilii C-5 culture resulted in nematicidal activity of 89% after 3days. Meanwhile, treating with 2.5 mg/L of chemical nemato pesticide Fosthiazate (a.i. 5%) and 2,000 ㎕/L of neem oil (azadiractin 0.3%) resulted in 17% and 57% of nematicidal activity, respectively. When Meloidogyne incognita containing pots were treated with 5,000 mg/kg of A. thaumasia Nema-1 nematicide powder, the number of nematode''s egg sac, which is an index of nematicidal activity, decreased to 35% compared to that of the control. The number of nematode''s egg mass decreased to 67% when the nematicide powder mixture of 5,000 mg/kg A. thaumasia Nema-1 and B. subtilis C-9 was used in treating the pots. Furthermore, the mixture containing cinnamon extract 10 mg/kg, 5,000 mg/kg of A. thaumasia Nema-1 and B. subtilis C-9 nematicide powder decreased the number of nematode''s egg sac to 81%, whereas the corresponding reduction caused by 1.2 mg/kg of chemical nemato pesticide Fosthiazate (a.i. 5%) was recorded as 24%. Based on the results, the mixture of microorganisms and cinnamon extract could be recognized as more effective biological nematicide than the use of microorganism or plant extract along for the control of nematodes.
A protease of Burkholderia stabilis SAph-24 (NHB: Nematophagous fungus Helper Bacteria) was purified to homogeneity by a combination of ammonium sulphate precipitation and gel filtration chromatography. The molecular weight of the enzyme was 45 kDa by SDS polyacrylamide gel electrophoresis. When the protease production was estimated using the growth medium containing 0.7% KH2PO4, 0.2% K2HPO4, 0.01% MgSO4.?7H2O, 0.05% citric acid dehydrate, 0.1% yeast extract 0.2% casein with 1% inoculum, the optimum protease activity was recorded as 116.4 U/mL after 48 hr shaking incubation at 150 rpm. The enzyme was active in pH range of 5-11 and temperature range of 30 ~ 80oC. The optimum pH and temperature for protease activity were recorded as being pH 8 and 50oC respectively. The protease activity was inhibited by Zn2+, Ni2+ and Sn2+ and enhanced by Ca2+, Mg2+ and Mn2+. The maximum enzyme activity was displayed with casein as the substrate, followed by egg albumin, gelatin and BSA. When the casein was used as a substrate, Vmax and Km values were 89.28 U/mL and 0.82 mg/mL respectively.