본 연구는 CMV, LMoV, LSV 등의 다종바이러스 저항성 유전자를 도입한 백합 형질전환체를 획득하고, 이미 육성된 제초제 저항성 형질전환체와 화색유전자 도입백합 형질전환체의 유전분석을 위해 다음과 같이 수행되었다.
1. 백합의 주요 바이러스인 CMV, LMoV, LSV 에 저항성을 가지는 형질전환 백합을 육성하고자 하였다. 다종바이러스 저항성 백합의 개발은 PFGC와 pPZP-bar vector를 Agrobacterium tumefaciens strain EHA105로 도입하여 이용하였는데, PFGC vector는 35S promoter 하에 phophinothricin 유전자와 Virus resistant 유전자를 삽입 하여 제작되었고, Virus resistant 유전자는 CMV, LMoV, LSV의 Coat protein 유전자와 replicase 유전자 염기서열 중 200bp 씩 각각 다르게 조합한 3가지 종류의 Vector LV1(CMVCP-LMoVCP-LSVCP), LV2(CMVCP-LMoVCP-LSVCP), LV3(CMV2a- LMoVHCPro-LSVRep)로 intron을 사이에 두고 sense 와 antisense 방향으로 된 RNAi vector로 제작되었다.
아울러 GUBQ1(Gladiolus polyubiquitin promoter) 와 함께 LV1(CMVCP- LMoVCP-LSVCP), LV2(CMVCP-LMoVCP-LSVCP), LV3(CMV2a-LMoVHCPro -LSVRep)를 가 삽입된 pPZP-bar LV Vector를 형질전환에 사용하였다. 동양계 백합과 나팔나리 인편에서 유도된 배발생 캘러스를 위의 Vector가 포함된 Agrobacterium tumefaciens EHA105 starin을 접종하여 형질전환 시켰다. 2mg/L phosphinotrichin이 포함된 한천배지를 제작하여 저항성을 가지는 callus를 선발하였고, 식물 재분화 과정을 통해 PFGC-LV1 약 100여개, LV 2 형질전환체 약 60개, LV 3 형질전환체 30개를 얻을 수 있었다. pPZP-bar Vector를 이용한 형질전환에서는 LV 3가 도입된 형질전환체 5개가 획득되었다. 재분화된 형질전환 식물체의 크기가 매우 작고 잎의 수가 적어 유전분석이 가능한 PFGC-LV 3의 식물체를 대상으로 bar PCR을 실시한 결과 345bp 의 bar gene 절편체 증폭이 확인되어 Genomic DNA로의 도입을 확인하였다.

2. 입자 가속기를 이용하여 제초제 저항성 유전자(bar)가 삽입된 pDM302 Vector DNA로 형질전환 된 동양계백합 ''Marcopolo''의 표현형을 조사하고, 도입된 유전자의 Copy 수와 삽입 위치 분석을 위한 연구를 수행하고자 하였다.
제초제 저항성 형질전환백합의 표현형분석은 BASTA (phophinothricin 0.1%(W/V))를 2011년 9월 16과 2013년 7월 12일 살포 방식으로 두 차례 실시하고 제초제 저항성을 측정한 결과 비 형질전환체는 모두 고사 하였고, 5번, 9번, 15번, 33번, 44번 과 교배 후대 15번과 20번 2개 교배 계통, 90번과 15번 2개 교배 계통, 97번과 96번 2개 교배 계통과 ''Stargazer'' 와 84번 1개 교배 계통에서 4점 이상으로 뚜렷한 저항성을 보이는 것으로 확인되어졌다.
제초제 저항성이 높은 LM 형질전환체 9개 계통을 대상으로 유전분석을 실시 하고자 bar gene PCR 분석을 통해 검정하였으며, 9 계통 모두 375bp의 bar gene band를 확인 하여 형질전환 백합으로의 유전자 도입을 확인하였고, 유전자의 삽입 수와 삽입 위치를 확인하고자 Inverse PCR을 실시하여 LM 15 3개, LM 33 1개, LM 44 3개, LM 126번 3개씩 삽입되었음을 확인하였다.
삽입유전자의 Flanking region의 염기서열을 분석한 결과는 일부 형질전환체의 삽입 부위가 수용성 protein 이나 다른 유전자와 일부 일치하는 결과를 확인하였다. 이를 통해 본 식물이 형질전환체임이 입증되었으며, 기존의 삽입 수 분석을 위한 Southern blotting과 다른 방법인 Inverse PCR을 통해 유전분석이 가능하였고, Flanking region의 위치도 분석 할 수 있는 방법이 확립되었다.

3. 화색 유전자 형질전환은 백합에서 실용화 되고 있지 않기 때문에 플라보노이드 생합성 관련 유전자 f3‘5’h 유전자를 백합에 도입하여 파란색 백합을 육성의 기초를 마련하고자 형질전환을 실시된 바 있다.(Park. 2007)
형질전환 백합 32계통을 대상으로 f3‘5’h, hygromycin B, gus A, mgfp5'' PCR을 통해 4가지 유전자 각각에 해당하는 gene band 확인을 통해 유전자의 도입을 확인하였다. 그중 6개 계통 5, 13, 15, 20, 23, 27의 삽입 수, 삽입 위치 분석을 위하여 Inverse PCR을 통해 5번 1개, 15번 2개 20번 2개 27번 4개 27번개의 삽입 수에 따른 크기가 다른 band를 확인하였으며, 15번 밴드 2개 중 한 가지 밴드가 백합 Genomic DNA의 xylene Sequence와 일치하는 것으로 보아 그 부위에 삽입되었음을 확인하였다. 이를 통해 본 식물이 형질전환체임이 입증되었으며, 기존의 삽입 수 분석을 위한 Southern blotting과 다른 방법인 Inverse PCR을 통해 유전분석이 가능하였고, Flanking region의 위치도 연구 가능함을 입증하였다.

본 연구결과 형질전환을 통해 높은 효율로 CMV,LMoV,LSV 바이러스 저항성 유전자가 도입된 형질전환체를 육성할 수 있었다. 아울러 제초제 저항성, flavonoid 3''5'' hydroxylase 형질전환체의 PCR, RT-PCR 을 통해 형질전환체임을 입증하였고, Inverse PCR을 응용하여 각 형질전환체의 도입된 유전자 수 및 삽입 위치를 확인할 수가 있어서 Southern blot hybridization 이 매우 어려운 백합의 형질전환체의 유전분석 방법을 개발할 수 있었다.

This study was conducted to achieve transgenic lilies which contain virus genome sequences of CMV, LMoV, and LSV that may confer them traits of the multi virus resistance, and to analyze genetic states of transgene insertions in previously acquired transgenic lilies, which had been transformed with genes of a herbicide tolerance or a flower color related gene encoding flavonoid 3’,5’ hydroxylase.

1. Experiments were conducted to transform lily plants with virus genome sequences that confer virus resistance to the major viruses of lilies, CMV, LMoV, and LSV. T-DNA vectors, pFGC and pPZP-bar, were constructed to have three combinations of 200 bp of three genes, (coat protein, Helper protein or replicase genes) as shown LV1 (CMVCP-LMoVCP-LSVCP), LV2 (CMVCP-LMoVCP-LSVCP), and LV3 (CMV2a,LMovHCPro-LSVPrp), and transformed into AgrobacteriumtumefaciensstrainEHA105 Embryogenic calli, induced from scales of a Oriental lily, ''Sorbonne'' on MS medium supplemented with 2 mg/L of picloram, were transformed by inoculation with the bacterium above and selected for transformation on the same medium containing 2mg/L. After over six passages of the subcultures of the selection, plantlets were regenerated from the selected calli, 94, 49 and 24 of pFGC-LV1, LV2, LV3 were obtained respectively. Five plantlets were obtained from the cultures transformed with the pPZP-bar-LV3. As the transgenic plantlets were in small bulblet stages, leaflets of a few transgenic plantles were detached and used for PCR analysis, where the selection marker of the vectors, bar, were positively amplified only in the transformed confirming the introduction of the transgene in the lilies.

2. Previously transformed Oriental lily ‘Marcopolo” with pDM302 vector DNA biolistically were characterized to examine the inheritance of the inserted herbicide tolerance gene, bar among selfed or cross hybridized progenies, And the transgenic lilies were analysed to examine the copy number of the transgene and their insertion sites. To evaluate the trait of the herbicide tolerance, transgenic lilies were sprayed with 0.1% phophinothricin and the evaluations were repeated twice in 2011 and 2013. non transgenic control lilies were all dead, transgenic lines of LM5, LM9, LM15, LM33, and LM44 were highly resistant to the herbicide treatments. Among the progenies of the transgenic lines, selfed T1 progenies of LM15 and, those of cross hybridizationsng among LM15,20, 96 and ''Stargazer'' showed strong resistance to the herbicide indicating that the traits of the herbicide gene were inherited to the progenies and expressed to confer the expected phenotype. Inverse PCR analyses were conducted to check the the copy number of transgene and their insertion sites along the genome of the transgenic lilies. Transgenic lines of LM15, LM33, LM44, and LM126 showed different sizes and numbers of inverse PCR bands indicating their insertion copies of one to threeBase sequences of flanking regions of the insertions wereanalysed in sometransgenic lilies and one sequences matched withth known sequences such as Xylanase, which indicated that that insertion was occurred within a coding sequence of the genomic lily. As the southern hybridization is known to be very difficult, and therefore, this inverse PCR protocols shall be useful to cahracterise tragenic plants of lilies.

3. Transgenic lilies of flavonoid 3’5’hydroxylase gene were utilized for iPCR. The transgenic plant line of 5, 13, 15, 20, 23, and 27 were tested through Inverse PCR and various copy numers were confirmed among those plants. Sijgle copy insertin was confirmed in the line number 5, two copies in 15, 20, and four in number 27. Base sequences of a flaking region of the bands of number 15 matched with xylene sequence of lily genomic DNA which means the gene was inserted in the coding sequences of the gene.

In conslusions, transgenic plants ontaining virus sequences of CMV, LMoV, LSV viruses were effectively obtained, which shall be examined their newly obtained traits of virus resistance. Inverse PCR analyses using previously developed herbicide resistant and flavonoid 3''5''hydoxylase gene transgenic lilies showed various numbers of transgene copies amon those plants and allow to characterize the sequences of the flanking regions of the transgenes, chich techniques shall be useful in the characterization of transgenic lilies and their further utilizations.