돼지생식기호흡기증후군(PRRS) 바이러스는 돼지에서 생식기 질환 및 호흡기 질병을 유발하는 원인체로서, 현재까지 알려진 돼지 병원체 중 전 세계 양돈 산업에 가장 많은 경제적 손실을 입히는 것으로 알려져 있다. 특히, 미국에서는 연간 6억 6천만불, 한국에서는 약 1000억원 이상의 경제적 손실을 입히고 있는 것으로 보고되고 있다.
이러한 PRRS 바이러스는 외피로 둘러쌓인 약 15kb의 positive-sense 단일 RNA를 유전체로 가지는 바이러스이며, Arteriviridae 과(family)에 속해 있고, 중증급성호흡기증후군(SARS) 코로나바이러스가 속해있는 Coronaviridae 과(family)와 함께 Nidovirales 목(order)에 속해 있다. PRRS 바이러스는 항원적 그리고 유전학적 차이로 인해 유럽형(genotype 1) 과 북미형(genotype 2)로 구분되어 진다. 또한, 제한적인 세포 친화성으로 인해 돼지 폐포대식세포에서 주로 증식하며 그 결과, 대식세포의 기능과 면역 반응을 억제하므로 인해 2차 세균 감염과 바이러스 감염을 초래하는 것으로 알려져 있다. 그리고 PRRS 바이러스는 숙주 상에서 6개월 이상 지속감염을 가능케 하며, 이는 PRRS 바이러스가 type 1 인터페론을 포함한 내재면역반응 체계를 조절하여, 획득면역 약화로 인한 결과로 유발되는 것으로 추측되어 지고 있다.
PRRSV는 작은 크기의 외피로 둘러싸인 형태를 하고 있으며 약 15kb 사이즈의 단일가닥 양성 RNA 유전체를 지니고 있다. PRRSV의 유전체는 5''말단과 open reading frame(ORF)1a, ORF1b, ORF2a, ORF2b, ORF3부터 ORF5a를 포함한 ORF7까지 포함하고 있으며 3''말단에는 폴리 아데닐화된 꼬리가 존재한다. ORF1a와 ORF1b는 1a와 1ab라는 폴리단백질로 번역되어 이것이 13개의 비구조단백질로 잘려서 각각의 기능을 수행한다. ORF2a부터 ORF7까지는 막 연관 단백질인 GP2a, 2b 또는 E, GP3, GP4, GP5, GP5a, M과 N단백질로 각각 subgenomic mRNA의 형태로 전사되어 번역되게 된다.
최근에 기능과 영향이 제대로 밝혀지지 않은 새로 발견된 ORF가 PRRS 바이러스의 유전체에 존재함이 밝혀졌고 이 단백질은 subgenomic mRNA 5에 암호화 되어 있는 주요 외피 당단백질인 GP5에 같이 암호화 되어 있다. 이 단백질을 ORF5a라 명명하고 PRRS 바이러스를 포함한 모든 arterivirus에도 이 단백질이 발견되며, 약 43에서 64개의 아미노산으로 이루어져 있는 것으로 알려졌다.
본 연구에서는 PRRS 바이러스가 감염하는 숙주 세포의 ORF5a 단백질의 발현에 따른 세포 유전자 발현의 변화량을 관찰하고자 한다. 연구를 위해서 돼지 폐포대식세포주(porcine aveolar marcrophage; PAM) 에 PRRS 바이러스 ORF5a 단백질을 안정적으로 발현하는 세포주를 우선 제작했다. ORF5a 단백질의 발현량을 형광항체법, FACS, 웨스턴 블랏 등을 통해서 확인하였고, 단백질 발현에 의해 시간대 별로 변화하는 PAM cell의 세포 단백질의 변화량을 two-dimensional gel electrophoresis (2DE)를 통해서 36개의 단백질 spot을 선별하였다. 이 중 16개의 단백질 spot이 통계적으로 유의성 있는 변화량을 보여주었으며 이 단백질들은 13개의 up-regulation과 3개의 down-regulation 양상을 나타냈다. 이 16개의 단백질의 정보를 밝히기 위해 matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry (MALDI-TOF/MS)와 peptide mass fingerprinting (PMF)를 통해서 단백질 정보를 확인하였다. 확인된 단백질들이 세포 성장, 세포골격 네트워크, 세포 간 신호전달, 대사 작용, 단백질 생합성, RNA processing, 수송 작용 등에 관련된 다양한 기능 들을 갖고 있음을 알 수 있었다.
단백질 수준에서의 변화량을 mRNA 수준에서도 동일한 패턴을 가지는지 real-time quantitative RT-PCR을 통해서 다시 한 번 확인하였다. 이 중에서 세포골격에 관여하는 vimentin과 adseverin, heterogeneous nuclear ribonuclear protein (hnRNPs) A1, K 단백질이 PAM 세포 내에서 발현량이 눈에 띄게 변화한 것을 관찰 할 수 있었다. 이 4가지 단백질에 대해서 6, 12, 24, 48 각 시간에서 ORF5a 단백질의 증가에 따른 PAM 세포 내에서 변화량을 웨스턴 블랏으로 확인하였다. 더불어 PRRS 바이러스 감염되어진 PAM 세포에서도 동일한 결과를 확인하였다.
이 PRRS 바이러스의 ORF5a 단백질이 바이러스 생장에 필수적인 단백질인지 확인하기 위해서 PRRS 바이러스 감염성 클론을 이용하여 ORF5a 단백질 유전자를 knock-out 시킨 mutant clone을 제작하였다. Wild-type PRRSV infectious clone과 ORF5a 단백질이 knock-out된 mutant clone을 BHK-pCD163-tailless cell에 transfection시킨 결과 mutant clone에서 viable한 virus가 숙주세포로부터 만들어지지 않았다. 이 결과가 ORF5a 단백질 발현의 부재 때문인지 검증하기 위해서 BHK-pCD163-tailless cell에 ORF5a 단백질을 안정적으로 발현하는 세포주를 제작하였고 이 세포주에 동일한 transfection 실험을 한 결과 세포에서 공급되는 ORF5a 단백질 발현에 의해 viable 한 virus가 만들어지는 것을 확인하였다. 이로써 ORF5a 단백질이 PRRS 바이러스가 생장하는데 있어서 필수적인 단백질임을 확인 할 수 있었다.
앞에서 새로운 ORF5a 단백질의 분자적 특징과 숙주세포에 주는 영향, 바이러스 생장에 필수적인 요소 등의 정보에 대해서 살펴보았다. 이러한 정보와 더불어 PRRS 바이러스 생장에 어떤 부분에서 영향을 미치는지, 숙주세포와의 면역작용에 어떤 작용을 미치는지에 대한 연구가 더 진행되면 PRRS 바이러스 백신 생산에 있어서 도움이 될 것이라고 판단된다.

Porcine reproductive and respiratory syndrome (PRRS) is a devastating swine disease that appeared almost simultaneously in North America and Europe in the late 1980s. The causative agent of this disease, the PRRS virus (PRRSV), is an enveloped single-stranded positive-sense RNA virus with a diameter of 50-65nm. PRRSV belongs to family Ateriviridae, which together with family Coronaviridae form the order Nidovirales. PRRSV is divided into two distinct genotypes, the European (EU) type 1 genotype and the North American (NA) type 2 genotype.
PRRSV possesses the 5''-capped and 3''-polyaddenylated genome of about 15 kb in size, which consists of the 5'' untranslated region (UTR), at least nine open reading frames (ORF1a, ORF1b, ORF2a, ORF2b, and ORFs 3 through 7), and the 3'' UTR. Two large ORFs 1a and 1b comprised 80% of the genome encode nonstructural protein (NSPs), whereas the remaining ORFs in the 3'' terminal 3 kb region code for structural proteins including seven membrane-associated structural proteins (GP2, E, GP3, GP4, GP5, 5a, and M) and nucleocapsid (N) proetein. ORFs 1a and 1b are translated as a single poly-protein, which is then processed into smaller nonstructural proteins. NSP1-α, NSP1-β, NSP2, and NSP4 are proteases that cleave that entire ORF1 polyprotein into 14 NSPs. Other ORFs located at the 3'' end of the genome encode the viral structural proteins. Recent evidence also suggests the existence of an additional ORF, 5a is encoded in an alternative reading frame of subgenomic mRNA 5, which precedes tahe initiation site of the major envelope glycoprotein, GP5.
As a first step toward understanding the biological function of the ORF5a protein in PRRSV replication, the present study was conducted to investigate compensatory changes of cellular gene expression in natural target cells regulated by the ORF5a. We first established sublines of PAM cells to stably express the PRRSV ORF5a protein and assessed alterations in cellular protein productions of ORF5a-expressing PAM (PAM-ORF5a) cells at different time courses by the use of proteomic analysis. A total of 36 protein spots were initially found to be differentially expressed in PAM-pCD163-ORF5a cells compared with normal PAM cells by high-resolution two-dimensional gel electrophoresis (2DE). Of these spots, 16 protein spots with statistically significant alteration, including 13 up-regulated and 3 down-regulated protein spots, were picked out for subsequent protein identification by peptide mass fingerprinting after matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry (MALDI-TOF/MS). The altered cellular proteins identified in this study were grouped into the functions associated with a variety of cellular processes such as cell growth, cytoskeleton networks and cell communication, metabolism, protein biosynthesis, RNA processing, and transportation. The proteomics data will provide valuable information for better understanding the specific cellular response to the novel ORF5a protein during PRRSV replication.
And also to test ORF5a protein function in PRRSV replication, a DNA-launched reverse genetics system was developed from a type 2 porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV) strain, RCM23. The complete genome of 15,444 nucleotides was assembled as a single cDNA clone and placed under the eukaryotic CMV promoter. Upon transfection of BHK-pCD163 cells with a full-length cDNA clone, viable and infectious type 2 progeny PRRSV was rescued. The reconstituted virus was found to maintain growth properties similar to those of the parental virus in porcine alveolar macrophage (PAM) cells. With the availability of this type 2 PRRSV infectious clone, we first explored the biological relevance of ORF5a in the PRRSV replication cycle. Therefore, we used a PRRSV reverse genetics system to generate an ORF5a knockout mutant clone by changing the ORF5a translation start codon and introducing a stop codon at codon 7th of ORF5a. The ORF5a knockout mutant was found to exhibit the lack of infectivity in both BHK-tailless CD163 and PAM-pCD163 cells, suggesting that inactivation of ORF5a expression is lethal for infectious virus production. In order to restore the ORF5a gene-deleted PRRSV, complementing cell lines was established to stably express the ORF5a protein of PRRSV. ORF5a-expressing cells were capable of supporting the production of the replication-defective virus, indicating complementation of the impaired ORF5a gene function of PRRSV in trans.