Pulmonary toxicity of polyhexamethyleneguanidine-phosphate in human bronchial cells co-culture model : 사람 기관지 세포 co-culture 모델에서의 Polyhexamethyleneguanidine-phosphate의 흡입독성 영향 :

박창위

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자료유형: 학위논문

저자정보: 박창위 (성균관대학교, 성균관대학교 일반대학원)

지도교수: 정규혁

발행연도: 2014

저작권: 성균관대학교 논문은 저작권에 의해 보호받습니다.

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이 논문의 연구 히스토리 (2)

2014

Pulmonary toxicity of polyhexamethyleneguanidine-phosphate in human bronchial cells co-culture model : 사람 기관지 세포 co-culture 모델에서의 Polyhexamethyleneguanidine-phosphate의 흡입독성 영향

박창위 약학과 2014.01 학위논문

2013

RAW 264.7 세포에서의 Polyhexamethyleneguanidine-phosphate 세포독성 및 염증반응 연구

박창위 , 박솔 , 추운학 외 3명 환경독성보건학회 심포지엄 및 학술대회 2013.05 학술대회자료

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2011년 8월 31일, 질병관리본부에서 가습기 살균제에 의한 원인미상폐손상으로 수명의 인명 손실이 있었다는 발표가 있은 이후 원인물질로 추정한 Polyhexamethyleneguanidine-phosphate (PHMG-phosphate)가 폐독성을 유발 하는 지에 대한 연구가 필요하게 되었다. PHMG-phosphate는 가습기에서 분무되는 물에 희석하여 사용함으로써 에어로졸 형태로 인체에 흡입되었고 ‘아급성의 파괴적이고 폐쇄적인 세기관지염 및 섬유화(Subacute destructive and obliterative bronchiolitis and fibrosis)’를 유발한 것으로 추정하고 있다. 이 질환은 폐포에서 발생하는 보통의 섬유화와 다르게 세기관지에서 섬유화가 일어난다는 것이 특징이다. 섬유화는 매우 복잡하고 다양한 기전에 의해 유발되는 질병인데 그 중 공통된 기전이 ‘상처 치유(Wound healing) 기전’이다. 상처 치유 기전은 손상 단계, 염증 단계, 회복 단계로 나뉠 수 있다. 이 때, 회복이 정상적으로 일어나지 않아 이 단계들이 반복이 될 경우 과량의 세포외 기질이 쌓여 섬유화로 발전한다.
따라서 본 연구는 기관지 상피세포, 대식세포, 비만세포를 공동 배양(Co-culture) 하여 인체와 유사한 환경을 in vitro 상에서 조성하여 PHMG-phosphate의 세포독성, 활성산소의 발생, 기관지 상피벽의 손상과 섬유화를 일으키는 염증반응을 확인하였다.
본 연구에서는 in vitro 상에 인체와 유사한 환경을 조성하기 위해 상피세포, 대식세포, 비만세포를 기체-액체 경계면(Air-liquid interface, ALI)으로 공동 배양한 후, PHMG-phosphate 폐독성 영향 실험에 사용하였다. PHMG-phosphate의 세포독성 영향을 보기 위해 WST-1 시험을 이용하여 농도 의존적으로 세포 생존도가 감소하는 것을 확인하고 1, 6, 24 시간을 노출하였을 때, LC50가 각각 63.10, 63.42, 31.61 ppm임을 구하였다. 활성산소가 PHMG-phosphate에 의해 농도 의존적으로 대조군 대비 142.90 ± 10.13 %까지 증가한다는 것을 DCFH-DA 시약을 이용하여 확인하였다. 상피벽의 손상을 확인하기 위해 TEER과 투과도를 측정하였고 면역형광법과 real-time PCR을 수행하였다. PHMG-phosphate는 농도 의존적으로 TEER 값을 대조군 대비 3.87 ± 1.17 %까지 감소시켰으며 투과도를 대조군 대비 596.11 ± 149.57 %까지 증가시키고 부착연접을 파괴하였다. 또한 metalloproteinase (MMP)-2, MMP-9, tissue inhibitor of metalloproteinase (TIMP)-1, TIMP-2를 유의적으로 증가시켰다. 마지막으로 ELISA 시험법을 통해 PHMG-phosphate가 섬유화와 관련되는 사이토카인인 TNF-α, IL-6, IL-8, TGF-β1을 유의적으로 분비시킨다는 것을 확인하였다.
결론적으로 ALI로 배양된 기관지 co-culture 시험계에서의 PHMG-phosphate는 폐 섬유화와 연관된 세포독성, ROS 생성, 상피벽 손상, 사이토카인 분비를 유도하는 것으로 사료된다.

Polyhexamethyleneguanidine-phosphate (PHMG-phosphate) is an effective water soluble biocide for bacteria, yeasts, and molds. However, recently there was an inhalation safety issue for PHMG-phosphate used humidifiers. Korea Centers for Disease Control and Prevention reported on August 2011 that PHMG-phosphate might be causative chemical for subacute destructive and obliterative bronchiolitis and fibrosis, which was rapidly progressive. Therefore, the aim of this study was to investigate whether PHMG-phosphate caused fibrogenic responses and its mechanism in human bronchial epithelium simulated cell culture model. Human bronchial epithelium carcinoma cells, human monocyte cells, which differentiate into macrophages, and human mast cells were co-cultured by air-liquid interface (ALI) method. The ALI triculture-cell system was established with the confirmation of measuring transepithelial electrical resistance (TEER), visualizing cell-cell junction formation, and mucus secretion. To evaluate PHMG-phosphate-induced toxicity in established cell culture model, cytotoxicity test was carried out by WST-1 assay and lethal concentration 50 (LC50) was calculated as 63.10, 63.42, and 31.61 ppm for 1, 6, and 24 h exposure, respectively. The reactive oxygen species (ROS) generation in triculture model exposed by PHMG-phosphate was detected up to 142.90 ± 10.13 % of control using DCFH-DA assay. To investigate fibrosis mechanism, barrier injury was analyzed by performing TEER measurement, paracellular permeability assay, immunofluorescence, and real-time PCR. PHMG-phosphate decreased TEER to 3.87 ± 1.17 % of control, increased permeability by 596.11 ± 149.57 %, and destructed cell-cell junction in a dose-dependent manner. Furthermore, matrix metalloproteinase (MMP)-2, MMP-9, tissue inhibitor of metalloproteinase (TIMP)-1, and TIMP-2 mRNA levels were aberrantly elevated. PHMG-phosphate significantly enhanced secretion of fibrosis-related inflammatory cytokines which are TNF-α, IL-6, IL-8, and TGF-β1. In conclusion, PHMG-phosphate may provoke fibrogenic responses through cytotoxicity, ROS generation, epithelial barrier injury, and profibrotic cytokine secretion in human bronchial epithelial triple-cell co-culture model. This study is the first progress to figure out the fibrogenic effects and its mechanism caused by PHMG-phosphate in vitro. Further studies should be executed to confirm the direct extracellular matrix non-degradative effect of PHMG-phosphate.

#polyhexamethyleneguanidine-phosphate #PHMG-phosphate #pulmonary toxicity #injury #inflammation #in vitro #co-culture #ALI culture

Contents ⅰ
List of figures ⅲ
List of tables ⅳ
Abstract 1
Ⅰ. Introduction 3
Ⅱ. Materials and Methods 12
1. Sample preparation 12
2. Cell culture 12
3. Transepithelial electrical resistance (TEER) measurement 14
4. Immunofluorescence 15
5. Periodic acid Schiff (PAS) staining 16
6. Cytotoxicity 16
7. ROS generation test 17
8. Paracellular permeability test 18
9. Real-time PCR 19
10. Detection of cytokines releases 20
11. Data analysis 21
Ⅲ. Results 23
1. Establishment of bronchial epithelial cells co-culture model 23
2. Effects of PHMG-phosphate on cell viability 26
3. Effects of PHMG-phosphate on ROS generation 28
4. Effects of PHMG-phosphate on epithelial barrier injury 31
4.1 Effects of PHMG-phosphate on epithelial barrier 31
4.2 Effects of PHMG-phosphate on MMPs and TIMPs 34
5. Effects of PHMG-phosphate on profibrotic inflammatory responses 36
Ⅳ. Discussion 38
Ⅴ. Conclusion 46
Ⅵ. References 47
국 문 요 약 69

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