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논문 기본 정보
- 자료유형
- 학위논문
- 저자정보
- 지도교수
- 최진희
- 발행연도
- 2014
- 저작권
- 서울시립대학교 논문은 저작권에 의해 보호받습니다.
이용수3
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최근 제조 나노 물질의 활용 분야가 넓어지면서, 이들 나노 물질의 환경 내 노출이 증가하고 있으나, 이에 대한 생태독성 연구는 부족한 실정이다. 특히 수생환경으로 유입되는 물질들의 최종 종착지인 퇴적물 내에서의 나노 생태 독성 연구는 제한적으로 이루어 지고 있다. 다양한 나노 물질 중, 대표적인 금속 나노입자인 은나노 입자는 뛰어난 항균작용으로 소비자 제품은 물론 의약학 분야에서도 널리 사용되고 있으나, 환경 내 배출에 따른 생태 및 인체 영향이 우려되고 있어, 은나노 입자 대한 생태 독성 연구가 활발히 진행되고 있다. 본 연구에서 실험종으로 사용된 Chironomus riparius는 대표적인 퇴적물 독성 모델로, 많은 생태독성 연구에서 사용되고 있으나, 게놈정보가 제한적으로 알려져 있어서 유전자 수준의 독성 연구에 한계를 가지고 있었다. 이에, 본 연구실에서는 454 GS-FLX 기법을 활용하여 C. riparius의 전사체 데이터 베이스를 확보하였다.
본 논문에서는 확보된 전사체 데이터베이스를 바탕으로 C. riparius에서 ecotoxicogemics 기법을 활용하여 은나노의 생태 독성 메커니즘 연구하였다. 일반적으로 은나노 독성은 산화적 스트레스를 유발하는 것으로 알려져 있으나, 이에 대한 메커니즘은 정확하게 규명되어 있지 않다. 본 연구에서는 먼저, 은나노에 의한 전사체 수준에서의 발현 연구를 위해서 대표적 NGS 기법 중에 하나인, Solexa sequencing 기법을 기반으로 한 RNA-seq 분석을 진행하였다. 이를 통해 은나노 노출에 의해 2배 이상의 발현 변화를 나타낸 896개의 전사체를 확인할 수 있었고, 유전자 정보 분석을 통해 234개 및 337개의 증가 혹은 감소된 유전자들(DEGs)을 확인 할 수 있었다. 이들 특이적 발현 유전자들을 이용한 은나노에 의한 특이적 독성 기작을 확인할 수는 없었지만, 이들DEGs 중 대부분은 대사 관련 유전자들이고, 특히 산화적스트레스 메커니즘 관련 유전자들이 상당 수 존재하는 것을 확인 할 수 있었다. 이는, 은나노에 대한 복잡한 전사체 수준에서의 반응이 주로 산화적 스트레스와 연관되어 있음을 보여준다. 보다 명확한 C. ripairus내 은나노 독성 기작을 찾기 위해서는 본 연구에서 얻어진 전사체에 대한 후속 연구가 필요할 것으로 보인다. 그러나, 본 연구를 통해NGS 기법을 이용한 전사체 발현 결과를 은나노 생태독성 연구에 활용할 수 있을 것으로 보이고, 이러한 전사체 연구 방법을 게놈정보가 부족한 환경 생태종 독성 연구에 대한 활용 가능성을 확인할 수 있다.
또한, in vitro및 in vivo기존 연구 결과를 통해 p38 MAPK단백질이 은나노 입자 유발 산화적 스트레스에서 중요한 역할을 한다는 것이 밝혀졌다. 이에, 본 연구에서는 C. riparius의 p38 유전자를 확인하여 분석하고, 은나노 노출에 의한 p38 유전자 발현 경향을 확인하였다. 이를 통해, C. riparius의 p38 유전자가 은나노 입자에 의한 산화적 스트레스 방어 기작에 관여하고 있다는 것을 확인할 수 있었고, 이 유전자의 은나노 입자에 대한 유전자 수준의 생체지표의 가능성을 확인할 있었다. 또한 실제 환경 내에서의 다양한 요소가 은나노 독성에 미치는 영향을 확인 하기 위해서 저산소 조건에서의 은나노 독성 연구와 퇴적물 존재 하에서의 코팅제에 따른 독성 연구를 수행하였다. 깔따구 종에서는 헤모글로빈이 산화적 스트레스에 중요한 역할을 수행하는데, 본 연구에서는 11개의 글로빈 유전자를 전사체 데이터 베이스 상에서 확인하여 분석하였다. 이들 글로빈의 유전자 수준 및 단백질 수준에서의 은나노입자, 저산소 조건 및 저산소 조건에서의 은나노 입자 조건에서의 발현을 확인한 결과를 보면, C. riparius 내 글로빈이 은나노에 대한 독성 메커니즘에서 중요한 역할을 가지고 있고, 이들에 대한 은나노에 대한 바이오마커로서의 가능성을 확인할 수 있었다. 특히, C. riparius의 글로빈 다형성은 이전 연구들에서 나타난 바와 같이 이 종의 환경 스트레스에 대한 유연성을 보여주고 있는데, 본 연구 결과에서도 비슷한 경향을 확인할 수 있었다. 또한 11개의 글로빈 유전자 중 특정한 노출조건 (은나노 및 저산소 조건, 혹은 카드뮴)에 대한 특이적 글로빈을 확인할 수 있었다. 또한, 저산소 조건과 같은 환경 내 물리적 조건에 의해서 은나노 노출에 따른 글로빈 유전자들의 발현 경향이 달라짐을 관찰할 수 있었는데, 이를 통해 용존 산소량의 변화와 같은 물리적인 환경 조건에 의해서 은나노 독성 메커니즘이 영향을 받을 수 있음을 확인하였다. 다양한 코팅 물질에 의한 은나노 독성 변화를 확인하기 위해 다양한 물질 (PVP, GA, Citrate)로 코팅된 은나노, 코팅되지 않는 은나노 및 은이온에 대한 스트레스 반응 유전자들의 발현 실험 및 유전독성 실험 수행 결과, PVP, citrate 코팅 은나노와 은이온 노출 조건에서 은나노 노출조건과 유사하게 유전독성 (DNA 손상)을 관찰할 수 있었다. 또한, 퇴적물의 유무, 코팅의 유무에 따라 스트레스 반응 유전자들의 발현 경향이 달라짐을 확인 할 수 있었다. 그러나, 급성 노출에서 가장 독성이 강한 것으로 보인 citrate 코팅 은나노의 경우 만성 노출에서는 코팅되지 않은 은나노와 은이온에 비해 거의 독성이 나타나지 않았는데, 이는 수계에서 코팅제로 인해 수계에서 이온화가 덜 이루어지고, 장기적으로 퇴적물 상에 침착되는 비율이 적어 상대적으로 만성 영향이 적은 것으로 보인다.
이들 결과를 통해, C. riparius에서의 은나노 독성은 주로 산화적 스트레스 및 DNA 손상을 유발하고, 저산소와 같은 환경적 조건이나 은나노 입자의 코팅 유무 등 노출 특성이 은나노 독성에 영향을 미칠 수 있음을 알 수 있다. 또한 C. riparius가 수생 및 퇴적물 조건에서의 휼륭한 나노 생태 독성 생물종임을 확인할 수 있었다.
본 논문에서는 확보된 전사체 데이터베이스를 바탕으로 C. riparius에서 ecotoxicogemics 기법을 활용하여 은나노의 생태 독성 메커니즘 연구하였다. 일반적으로 은나노 독성은 산화적 스트레스를 유발하는 것으로 알려져 있으나, 이에 대한 메커니즘은 정확하게 규명되어 있지 않다. 본 연구에서는 먼저, 은나노에 의한 전사체 수준에서의 발현 연구를 위해서 대표적 NGS 기법 중에 하나인, Solexa sequencing 기법을 기반으로 한 RNA-seq 분석을 진행하였다. 이를 통해 은나노 노출에 의해 2배 이상의 발현 변화를 나타낸 896개의 전사체를 확인할 수 있었고, 유전자 정보 분석을 통해 234개 및 337개의 증가 혹은 감소된 유전자들(DEGs)을 확인 할 수 있었다. 이들 특이적 발현 유전자들을 이용한 은나노에 의한 특이적 독성 기작을 확인할 수는 없었지만, 이들DEGs 중 대부분은 대사 관련 유전자들이고, 특히 산화적스트레스 메커니즘 관련 유전자들이 상당 수 존재하는 것을 확인 할 수 있었다. 이는, 은나노에 대한 복잡한 전사체 수준에서의 반응이 주로 산화적 스트레스와 연관되어 있음을 보여준다. 보다 명확한 C. ripairus내 은나노 독성 기작을 찾기 위해서는 본 연구에서 얻어진 전사체에 대한 후속 연구가 필요할 것으로 보인다. 그러나, 본 연구를 통해NGS 기법을 이용한 전사체 발현 결과를 은나노 생태독성 연구에 활용할 수 있을 것으로 보이고, 이러한 전사체 연구 방법을 게놈정보가 부족한 환경 생태종 독성 연구에 대한 활용 가능성을 확인할 수 있다.
또한, in vitro및 in vivo기존 연구 결과를 통해 p38 MAPK단백질이 은나노 입자 유발 산화적 스트레스에서 중요한 역할을 한다는 것이 밝혀졌다. 이에, 본 연구에서는 C. riparius의 p38 유전자를 확인하여 분석하고, 은나노 노출에 의한 p38 유전자 발현 경향을 확인하였다. 이를 통해, C. riparius의 p38 유전자가 은나노 입자에 의한 산화적 스트레스 방어 기작에 관여하고 있다는 것을 확인할 수 있었고, 이 유전자의 은나노 입자에 대한 유전자 수준의 생체지표의 가능성을 확인할 있었다. 또한 실제 환경 내에서의 다양한 요소가 은나노 독성에 미치는 영향을 확인 하기 위해서 저산소 조건에서의 은나노 독성 연구와 퇴적물 존재 하에서의 코팅제에 따른 독성 연구를 수행하였다. 깔따구 종에서는 헤모글로빈이 산화적 스트레스에 중요한 역할을 수행하는데, 본 연구에서는 11개의 글로빈 유전자를 전사체 데이터 베이스 상에서 확인하여 분석하였다. 이들 글로빈의 유전자 수준 및 단백질 수준에서의 은나노입자, 저산소 조건 및 저산소 조건에서의 은나노 입자 조건에서의 발현을 확인한 결과를 보면, C. riparius 내 글로빈이 은나노에 대한 독성 메커니즘에서 중요한 역할을 가지고 있고, 이들에 대한 은나노에 대한 바이오마커로서의 가능성을 확인할 수 있었다. 특히, C. riparius의 글로빈 다형성은 이전 연구들에서 나타난 바와 같이 이 종의 환경 스트레스에 대한 유연성을 보여주고 있는데, 본 연구 결과에서도 비슷한 경향을 확인할 수 있었다. 또한 11개의 글로빈 유전자 중 특정한 노출조건 (은나노 및 저산소 조건, 혹은 카드뮴)에 대한 특이적 글로빈을 확인할 수 있었다. 또한, 저산소 조건과 같은 환경 내 물리적 조건에 의해서 은나노 노출에 따른 글로빈 유전자들의 발현 경향이 달라짐을 관찰할 수 있었는데, 이를 통해 용존 산소량의 변화와 같은 물리적인 환경 조건에 의해서 은나노 독성 메커니즘이 영향을 받을 수 있음을 확인하였다. 다양한 코팅 물질에 의한 은나노 독성 변화를 확인하기 위해 다양한 물질 (PVP, GA, Citrate)로 코팅된 은나노, 코팅되지 않는 은나노 및 은이온에 대한 스트레스 반응 유전자들의 발현 실험 및 유전독성 실험 수행 결과, PVP, citrate 코팅 은나노와 은이온 노출 조건에서 은나노 노출조건과 유사하게 유전독성 (DNA 손상)을 관찰할 수 있었다. 또한, 퇴적물의 유무, 코팅의 유무에 따라 스트레스 반응 유전자들의 발현 경향이 달라짐을 확인 할 수 있었다. 그러나, 급성 노출에서 가장 독성이 강한 것으로 보인 citrate 코팅 은나노의 경우 만성 노출에서는 코팅되지 않은 은나노와 은이온에 비해 거의 독성이 나타나지 않았는데, 이는 수계에서 코팅제로 인해 수계에서 이온화가 덜 이루어지고, 장기적으로 퇴적물 상에 침착되는 비율이 적어 상대적으로 만성 영향이 적은 것으로 보인다.
이들 결과를 통해, C. riparius에서의 은나노 독성은 주로 산화적 스트레스 및 DNA 손상을 유발하고, 저산소와 같은 환경적 조건이나 은나노 입자의 코팅 유무 등 노출 특성이 은나노 독성에 영향을 미칠 수 있음을 알 수 있다. 또한 C. riparius가 수생 및 퇴적물 조건에서의 휼륭한 나노 생태 독성 생물종임을 확인할 수 있었다.
목차
Table of ContentsAbstractTable of Contents iList of Figures iiiList of Tables viI. Introduction 11.1. Background 11.2. Literature reviews 21.2.1. Ecotoxicogenomics 21.2.2. Next generation sequencing 51.2.3. Application of NGS for transcriptome analysis in non-model species 81.2.4. Nanoecotoxicology 111.2.5. Chironomus riparius 171.3. The aims of study 26II. Materials and Methods 28III. Results and Discussion 383.1. Transcriptome response to AgNPs in the C. riparius using RNA-seq 383.2. Molecular characterization and expression analysis of p38 MAPK gene and protein in the C. riparius exposed to AgNPs 483.3. Influence of environmental factors on AgNPs toxicity in the C. riparius 613.3.1. Toxicity of AgNPs combined with hypoxia on the globin gene and protein expression 613.3.2. Sediment toxicity of various coated and uncoated AgNPs in presence of sediment from natural environment 81IV. Conclusion 98References 100Supplementary Table 118Appendix 129Characterization and expression of superoxide dismutase genes in Chironomus riparius (Diptera, Chironomidae) larvae as a potential biomarker of ecotoxicity국문 초록 149
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