Role of RelA/p65 and α-smooth muscle actin of activated hepatic stellate cell in carbon tetrachloride-induced liver cirrhosis : 사염화탄소에 의한 간경화유도 과정에서 간성상세포의 활성에 RelA/p65와 α-smooth muscle actin의 역할에 관한 연구 :

Eunjeong Kim

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자료유형: 학위논문

저자정보: Eunjeong Kim (강원대학교, 강원대학교 대학원)

지도교수: 양세란

발행연도: 2015

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2015

Role of RelA/p65 and α-smooth muscle actin of activated hepatic stellate cell in carbon-tetrachloride-induced liver cirrhosis

Eunjeong Kim , Jeong-Ran Pa , k 외 4명 한국실험동물학회 학술발표대회 논문집 2015.02 학술대회자료

Role of RelA/p65 and α-smooth muscle actin of activated hepatic stellate cell in carbon tetrachloride-induced liver cirrhosis : 사염화탄소에 의한 간경화유도 과정에서 간성상세포의 활성에 RelA/p65와 α-smooth muscle actin의 역할에 관한 연구

Eunjeong Kim 의학과 2015.01 학위논문

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간 손상은 알코올의 남용과 B형/C형 간염 바이러스의 감염 등과 같은 다양한 원인들에 의해 발생한다. 간 손상 과정에서, 염증세포에서 분비하는 염증과 섬유화를 유발하는 사이토카인들은 휴지상태의 간성상세포의 활성화를 유도하며, 활성화된 간성상세포는 α-SMA와 세포외기질 (ECM) 성분들을 분비하는 섬유아세포로 전환분화되어 간 섬유화를 진행시킨다.
5개의 소단위 (p50, p52, cRel, RelA/p65, and RelB)로 구성된 NF-κB는 면역반응, 세포주기, 세포 생존과 관련된 전사인자로 잘 알려져 있다.
본 연구에서는 사염화탄소 (CCl4)에 의한 급성 (3일), 아만성 (4주) 간 섬유화 모델을 확립하였고 간경화의 발병에서 RelA/p65와 α-SMA의 관계를 조사하였다. 간 섬유화 모델을 확립하기 위해서 C57BL/6 마우스에 옥수수 오일로 희석한 (1:10) CCl4를 체중 g당 10 ㎕씩 3일 또는 4주간 복강내주사 하였다.
혈청학적 검사 결과, 혈청 내 알라닌아미노기전달효소 (ALT)와 아스파르트산아미노기전달효소 (AST)의 양이 3일과 4주에서 유의적으로 증가하였으며, 염증세포들의 유입과 섬유화된 격막의 축적과 같은 간 세포내의 변화 또한 3일과 4주에서 증가하는 것을 병리조직학적 관찰을 통해 확인하였다. RT-PCR 결과 3일에서 염증을 유발하는 사이토카인과 α-SMA, 4주에서 세포외기질성분과 α-SMA의 mRNA양이 증가하였으며, 혈청 내 IL-6과 TNF-α의 양이 3일에서 증가하는 것을 ELISA를 통해 확인하였다. Sirius-Red staining과 면역조직화학염색 결과 콜라겐의 축적과 α-SMA 단백질의 발현이 간문맥 주변에서 유사하게 관찰되었으며, CCl4를 주사한 마우스에서 RelA/p65의 핵내 이동과 인산화가 증가하였다. RelA/p65와 α-SMA의 상관관계를 확인하기 위해서 사람의 활성화된 간성상세포주인 LX-2 에 NF-κb의 억제제인 BAY 11-7082를 처리하였다. Western blot 결과, 핵내이동된 RelA/p65와 α-SMA의 단백질 발현이 BAY 11-7082를 처리한 LX-2에서 감소하였다.
본 실험의 결과들을 종합하면, 사염화탄소에 의해서 유도된 마우스의 간경화 모델에서 RelA/65와 α-SMA의 양이 증가하였으며 그들의 상호작용이 간경화의 발병에 중요한 역할을 할 것으로 여겨진다.

Liver injury is occurred by various causes, such as alcohol abuse and hepatitis B/C virus infection. During the liver injury, pro-inflammatory and fibrogenic cytokines released from inflammatory cells induce activation of quiescent hepatic stellate cell (qHSCs), and then the activated HSCs transdifferentiates to myofibroblasts release alpha smooth muscle actin (α-SMA) and extracellular matrix (ECM) components to progression of liver fibrosis.
Nuclear factor kappa B (NF-κB), which consists of five subunits (p50, p52, cRel, RelA/p65, and RelB), is a well-known transcription factor related to inflammatory response, cell cycle and survival.
In this study, carbon tetrachloride (CCl4)-induced acute (3 days) and sub-chronic (4 weeks) mice liver fibrosis models were established and relation of RelA/p65 and α-SMA in the pathogenesis of liver cirrhosis was investigated. To establish these liver fibrosis models, C57BL/6 mice were intraperitoneally injected with CCl4 (10 ㎕/g, diluted 1:10, v/v with corn oil) for 3 days and 4 weeks.
In serological analysis, serum alanine aminotrasferase (ALT) and aspartate aminotransferase (AST) levels were significantly increased in 3 days and 4 weeks. Hepatic cellular changes such as recruitment of inflammatory cells and deposition of fibrotic septa were increased at 3 days and 4 weeks in histological analysis. In RT-PCR analysis, mRNA levels of pro-inflammatory cytokines and α-SMA were increased in 3 days and mRNA levels of ECM components and α-SMA were up-regulated in 4 weeks. Serum IL-6 and TNF-α levels increased at 3 days in ELISA. In Sirius-Red staining and immunohistochemistry(IHC), similarly, collagen deposition and protein expression of α-SMA were observed in surrounding portal vein regions. In IHC, nuclear translocation and phosphorylation (Ser276) of RelA/p65 were increased in CCl4-injected mice. To determine the correlation between RelA/p65 and α-SMA in HSCs, human HSC line LX-2 cells were treated with NF-κB inhibitor BAY 11-7082. Protein levels of translocated RelA/p65 and α-SMA were decreased in BAY 11-7082 treated LX-2 cells in western blot analysis.
Taken together, in CCl4-induced mouse liver cirrhosis model, up-regulation of RelA/p65 and α-SMA levels, and their interaction play a key role in the pathogenesis of liver cirrhosis.

#liver fibrosis

I. INTRODUCTION --------------------------- 01
II. MATERIALS AND METHODS ------------------- 06
1. Chemicals and Antibodies
2. Animal Models
3. Experimental Design
4. Cell Culture and Treatment
5. Serum Biochemical Analysis
6. Hematoxylin and Eosin Staining (H&E staining)
7. Sirius-Red Staining
8. Immunohistochemistry (IHC)
9. RNA Extraction and Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction
(RT-PCR)
10. Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA)
11. Preparation of Protein Samples
12. Western Blot Analysis
13. Statistical analysis
III. RESULTS ------------------------------- 13
1. CCl4 increases the serum ALT and AST levels in liver fibrosis models
2. CCl4 induces recruitment of inflammatory cells and accumulation of ECM components in CCl4-injected mice.
3. CCl4 induces collagen deposition and α-SMA expression in CCl4-injected mice.
4. Nuclear translocation of total and phosphorylated (Ser276) RelA/p65 is crucial to progression of liver fibrosis.
5. Inhibition of nuclear translocation of RelA/p65 reduces α-SMA expression in LX-2 cells
IV. DISCUSSION --------------------------- 23
V. CONCLUSIONS -------------------------- 26
VI. REFERENCE ---------------------------- 27
VII. ABSTRACT ---------------------------- 29

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