닥나무(Broussometiakazinoki)는 아시아가 원산지로 산기슭의 양지쪽이나 밭둑에서 자라나는 쐐기풀목 뽕나무과의 낙엽활엽 관목이다. 닥나무의 근피는 구피마(構皮麻)라 하고 거풍(祛風), 이뇨(利尿), 활혈(滑血)의 효능이 있으며, 류머티즘에 의한 비통(鼻痛), 타박상(打撲傷), 부종(浮腫), 피부염(皮膚炎) 등을 치료한다. 닥나무에 대한 연구에는 항염, 항산화 및 종양 억제 효과 등에 대한 연구가 보고 되었다. 본 연구에서는 닥나무 근피의 항암 효능에 관한 지속적인 연구의 하나로 닥나무 근피 메탄올추출물이 A549 폐암세포의 증식에 미치는 영향과 apoptosis 지표인 caspases(caspase-3, -8, -9), PARP, pro-apoptotic 단백질, anti-apoptotic 단백질 및 MAPK 발현을 관찰하여 세포고사 유도 작용과 그 기전을 조사하였다. 실험 결과, 닥나무 근피 메탄올추출물은 인간 폐암 세포 주에서 상당한 독성을 나타내었다. DAPI 염색으로 apoptosis의 형태학적 특징인 세포 수축과 핵의 응축 및 분절을 확인 하였다. 닥나무 근피 메탄올추출물은 pro-apoptotic protein인 Bax와 Bak 단백질의 발현을 증가시켰고 anti-apoptotic protein인 Bcl-2 단백질의 발현을 감소시켰다. 그리고 caspase 3, -8, -9의 발현을 유도하였으며 poly ADP-ribose polymerase (PARP)의 분절을 일으켰다. 이러한 apoptosis의 MAPK관련 단백질을 조사한 결과, JNK/p38 MAPK의 활성 유도와 상위 신호인 ASK1이 활성을 확인할 수 있었다. 이상의 결과 닥나무 근피 메탄올추출물은 A549세포에서 미토콘드리아-caspases 경로를 통하여 apoptosis를 유도 하는 것으로 생각된다.
An extract of Broussometia kazinoki Rhizodermis has been traditionally used for geopoong(祛風), diuresis(利尿), hwalhyeol(滑血) containing treatment such as rhinalgia(鼻痛), contusion(打撲傷), edema(浮腫), dermatitis(皮膚炎) due to rheumatism. In the present study, the methanol extract of Broussometia kazinoki Rhizodermis (MBK) exhibited significant cytotoxicity in human lung cancer cell line. Herein, we investigated cytotoxicity mechanism of MBK in A549 cells. Based on DAPI staining, MBK-treated cells manifested nuclear shrinkage, condensation, and fragmentation. Treatment of A549 cells with MBK resulted in activation of the caspase-3, -8, -9 and cleavage of poly ADP-ribose polymerase (PARP). In the upstream, MBK increased the expressions of Bax and Bak, decreased the expression of Bcl-2, and augmented the Bax/Bcl-2 ratio. MBK-induced, dose-dependent induction of apoptosis was accompanied by sustained phosphorylation of JNK, p38 MAPK and apoptosis signal-regulating kinase (ASK)-1. These results suggest that MBK induced apoptosis in A549 cells through Bcl-2 protein family-mediated mitochndria/caspase-3-dependent pathway. In addition, MBK increased the activation of ASK1, which are critical upstream signals for JNK/p38 MAPK activation in A549 cancer cells.
목차
Ⅰ. 서 론 1Ⅱ. 실험재료 및 방법 41. 재 료 41) 약 재 42) 시 약 43) 세포주 54) 사용기기 52. 방 법 51) 시료 추출 52) 세포 배양 53) 세포 생존율 측정 64) Annexin V/PI 염색 65) Western blot 분석 66) 통계처리 7Ⅲ. 실 험 결 과 81. 닥나무 근피추출물의 A549 세포의 증식 억제 82. A549 세포의 염색질 응축에 미치는 영향 113. Caspase-3의 활성 134. PARP 분절에 미치는 영향 155. Anti-apoptotic 단백질 발현에 미치는 영향 176. Pro-apoptotic 단백질 발현에 미치는 영향 197. Caspase-8과 caspase-9의 발현에 미치는 영향 218. ASK1의 활성 239. p38, JNK의 활성 25Ⅳ. 고 찰 27Ⅴ. 결 론 31