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논문 기본 정보
- 자료유형
- 학위논문
- 저자정보
- 지도교수
- 김은희
- 발행연도
- 2015
- 저작권
- 전남대학교 논문은 저작권에 의해 보호받습니다.
이용수4
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Edwardsiella tarda에 의해 야기되는 에드워드병 (edwardsiellosis)은 연중 발생하지만 주로 고수온기에 중점적으로 발생하며 수온이 낮을 때는 수중에서 E. tarda가 거의 분리되지 않는다. 그러므로 수온이 낮은 환경에서 E. tarda는 viable but nonculturable (VBNC) 상태로 존재하다가 수온이 상승하면 소생하여 어류에게 질병을 일으킬 것이라는 의문이 제기된다. 본 연구에서는 10℃의 빈영양 해수에서 E. tarda의 VBNC 상태를 유도하고 소생가능성 및 소생된 E. tarda의 특성을 확인하고자 하였다.
10^8 CFU/ml의 E. tarda를 접종한 빈영양 해수 microcosm를 10℃에 유지하면서 VBNC 상태를 유도하였고 0.1 CFU/ml 미만의 배양 가능한 cell이 plate 상 계수 될 때 모든 cell이 VBNC 상태에 진입하였다고 판단하였다. E. tarda의 VBNC 유도 기간은 42 ~ 84일 까지 다양하였으나 평균 유도 기간은 약 70일 이였다. 유도 기간 중 Acridine oragne direct counting (AODC) 방법으로 계수한 총균수는 초기 접종 농도인 약 10^8 CFU/ml로 일정하였으며 모든 E. tarda가 완전히 VBNC 상태로 진입한 후에도 Direct viable counting (DVC) 방법으로 계수한 결과 여전히 대사활동을 하고 있는 VBNC cell은 약 10^4 CFU/ml로 확인 되었다. Ethidium monoazide (EMA)를 이용하여 VBNC E. tarda와 사균을 구별하고자 EMA 20 ~ 40 μg/ml로 microcosm을 처리했을 때 VBNC cell에서만 DNA 증폭이 확인되었다. 10^8 CFU/ml의 E. tarda로 10℃의 빈영양 해수 microcosm에서 유도한 VBNC cell의 농도는 10^4 ~ 10^5 CFU/ml 로 추정되었으며 이는 DVC 방법과 EMA - PCR 방법을 이용하여 확인한 결과가 서로 일치하였다.
VBNC E. tarda에 유기물을 첨가하여 25℃에서 소생을 유도한 결과 효모추출물 첨가구에서 37%, 근육추출물 첨가구에서 23%, 혈청 첨가구에서 37%의 소생율을 보였으며 다른 첨가물 없이 온도만 상승시킨 대조군에서도 30%의 소생률을 보였다. 또한 VBNC 상태로 10℃에서 10, 20. 30, 60일 동안 유지되었던 E. tarda의 소생률도 각각 20.8%, 75%, 56.2%, 10.7% 였다. 소생된 E. tarda의 배양 및 생화학적 성상을 분석한 결과 TSA와 SS 배지에서 소생된 E. tarda는 original E. tarda와 동일한 배양특성을 보였으며 API test와 특이 primer -PCR 결과에서도 모든 특성이 일치하였다. 소생된 E. tarda를 넙치 (Paralichthys olivaceus)에게 약 10^6 CFU/fish의 농도로 복강 주사 하였을 때 접종한 3일 후에 90% 이상의 폐사를 나타내었으며 폐사한 개체의 간과 신장에서 E. tarda가 검출되었으며 original 균과 유사한 독력을 나타내었다.
그러므로 온도가 상승하는 봄, 여름철 E. tarda에 의해 발생하는 어류 질병은 original cell에 의한 감염일 수도 있지만 수산양식장의 해수와 저질에서 발견되었던 VBNC cell이 환경수중에서 소생되어 지속적인 어류 발병의 원인체로 작용하는 것으로 생각된다.
10^8 CFU/ml의 E. tarda를 접종한 빈영양 해수 microcosm를 10℃에 유지하면서 VBNC 상태를 유도하였고 0.1 CFU/ml 미만의 배양 가능한 cell이 plate 상 계수 될 때 모든 cell이 VBNC 상태에 진입하였다고 판단하였다. E. tarda의 VBNC 유도 기간은 42 ~ 84일 까지 다양하였으나 평균 유도 기간은 약 70일 이였다. 유도 기간 중 Acridine oragne direct counting (AODC) 방법으로 계수한 총균수는 초기 접종 농도인 약 10^8 CFU/ml로 일정하였으며 모든 E. tarda가 완전히 VBNC 상태로 진입한 후에도 Direct viable counting (DVC) 방법으로 계수한 결과 여전히 대사활동을 하고 있는 VBNC cell은 약 10^4 CFU/ml로 확인 되었다. Ethidium monoazide (EMA)를 이용하여 VBNC E. tarda와 사균을 구별하고자 EMA 20 ~ 40 μg/ml로 microcosm을 처리했을 때 VBNC cell에서만 DNA 증폭이 확인되었다. 10^8 CFU/ml의 E. tarda로 10℃의 빈영양 해수 microcosm에서 유도한 VBNC cell의 농도는 10^4 ~ 10^5 CFU/ml 로 추정되었으며 이는 DVC 방법과 EMA - PCR 방법을 이용하여 확인한 결과가 서로 일치하였다.
VBNC E. tarda에 유기물을 첨가하여 25℃에서 소생을 유도한 결과 효모추출물 첨가구에서 37%, 근육추출물 첨가구에서 23%, 혈청 첨가구에서 37%의 소생율을 보였으며 다른 첨가물 없이 온도만 상승시킨 대조군에서도 30%의 소생률을 보였다. 또한 VBNC 상태로 10℃에서 10, 20. 30, 60일 동안 유지되었던 E. tarda의 소생률도 각각 20.8%, 75%, 56.2%, 10.7% 였다. 소생된 E. tarda의 배양 및 생화학적 성상을 분석한 결과 TSA와 SS 배지에서 소생된 E. tarda는 original E. tarda와 동일한 배양특성을 보였으며 API test와 특이 primer -PCR 결과에서도 모든 특성이 일치하였다. 소생된 E. tarda를 넙치 (Paralichthys olivaceus)에게 약 10^6 CFU/fish의 농도로 복강 주사 하였을 때 접종한 3일 후에 90% 이상의 폐사를 나타내었으며 폐사한 개체의 간과 신장에서 E. tarda가 검출되었으며 original 균과 유사한 독력을 나타내었다.
그러므로 온도가 상승하는 봄, 여름철 E. tarda에 의해 발생하는 어류 질병은 original cell에 의한 감염일 수도 있지만 수산양식장의 해수와 저질에서 발견되었던 VBNC cell이 환경수중에서 소생되어 지속적인 어류 발병의 원인체로 작용하는 것으로 생각된다.
목차
목 차 ⅰList of Tables ⅲList of Figures ⅳ국문초록 ⅶⅠ. 서 론 1Ⅱ. 재료 및 방법 051. 실험균주의 배양조건, 동정 및 독력 확인 052. VBNC 유도 및 소생 온도 설정 063. Edwardsiella tarda의 VBNC 유도 07가. Microcosm 제작 07나. E. tarda의 균수 변화 조사 081) 배양 가능한 세균수 (PC) 082) 전균수 (TC) 083) 생존 균수 (VBNC) 09다. Ethidium monoazide (EMA) - PCR법을 이용한 VBNC 농도측정 101) E. tarda의 생균과 사균 및 EMA stock solution 만들기 102) EMA 처리 103) 균 농도별 EMA 처리 104) VBNC E. tarda와 사균 구별을 위한 EMA 농도 설정 115) 특이 primer를 이용한 PCR 114. VBNC E. tarda의 소생 12가. 넙치 근육 추출물과 혈청 제작 12나. 배양 조건에 따른 VBNC E. tarda 소생률 비교 (in vitro) 125. 소생된 E. tarda의 특성분석 13가. 소생 균주의 확인 13나. 배양 및 생화학적 특성분석 13다. 병원성 확인 (in vivo) 13Ⅲ. 결 과 141. 실험균주의 동정 및 독력 142. 저온 빈영양 상태의 microcosm 내에 있는 E. tarda 개체 수 변이 14가. 배양 가능한 cell의 수 (PC), 전균수 (TC), 생균수 (VBNC) 변화 14나. VBNC 유도 기간 173. Ethidium monoazide (EMA) - PCR 18가. E. tarda의 생균과 사균의 구분 가능한 EMA 농도 18나. EMA 농도에 따른 E. tarda 생균 검출 한계 19다. VBNC E. tarda의 검출 214. VBNC E. tarda의 소생 22가. 조건에 따른 소생률 22나. VBNC E. tarda의 소생 시기 24다. 소생 후의 cell 수 변화 255. 소생된 E. tarda의 특성 분석 26가. E. tarda 특이 DNA band 확인 26나. 배양 및 생화학적 특성 27다. 소생된 균의 병원성 (in vivo) 31Ⅳ. 고 찰 33Ⅴ. 참고문헌 38Ⅵ. Abstract 44
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