광대버섯속은 분류학적으로 담자균문 주름버섯목 광대버섯과에 속한다. 대부분이 외생균근성균인 광대버섯속은 식물과의 공생관계를 가짐으로써 삼림생태의 중요한 역할을 담당하고 있다. 또한 분류군 내에 식용이 가능한 식용버섯과 인체에 치명적인 독성을 가진 독버섯이 공존해 있어 세계적으로 많은 관심을 가지고 있다. 대부분의 광대버섯 종들은 인공배양 또는 인공재배가 되지 않기 때문에 연구에 활용하기 어렵고 건조표본에서 DNA를 분리하기 어렵기 때문에 국내의 광대버섯 분류 연구는 형태적 계통연구 뿐만 아니라 분자유전학적 계통연구 또한 미흡한 실정이다. 비늘광대버섯아속 (subgenus Lepidella)은 광대버섯속내 두 아속 중 대부분이 외생균근성 공생균이고, 인체에 치명적인 독을 함유하는 독광대버섯군을 포함하는 분류군이다. 본 논문의 연구는 국내에서 채집된 비늘광대버섯 아속에 속하는 광대버섯류의 정확한 분류체계를 확립하고자 형태학적, 분자유전학적 계통분류를 목적으로 수행되었다. 또한 국내 독우산광대버섯에 의한 독버섯중독사고의 정확한 원인을 파악하는데 도움을 주고자 국내에 기존에 보고된 3 종과 본 연구에서 새로이 확인된 1종에 대해 분자 동정마커 제작을 시도하였다. 최근까지 한국에 자생하는 Lepidella 아속에 속하는 종은 4 개 절 32종으로 알려져 있으나 본 연구에서 형태학적 연구를 통해 총 4개 절 29종을 확인하였다. 큰주머니광대버섯절 (section Amidella) 3종, 알광대버섯절 (section Phalloideae) 8종, 비늘광대버섯절 (section Lepidella) 9종, 분질광대버섯절 (section Validae) 9종으로 분류 동정되었다. Amidella 절에 속한 종으로서는 큰주머니광대버섯 A. volvata, 신알광대버섯 A. neo-ovoidea, 화성알광대버섯(신칭) A. curtipes이 확인되었다. 이 중 미기록종으로 A. curtipes의 종 특징을 기술하고 한국명을 신칭하였으며, 3종에 대한 종분류검색표를 작성하였다. Phalloideae 절에 속한 종으로서는 회흑색광대버섯 A. fuliginea, 회색광대버섯(신칭) A. modesta, 장미광대버섯(신칭) A. pallidorosea, 암회색광대버섯 A. pseudoporphyria , 개나리광대버섯 A. subjunquillea, 독우산광대버섯 A. virosa, 흰알광대버섯아재비(신칭) A. oberwinklerana, 용문광대버섯(신칭) A. rimosa가 확인되었다. 이 중 미기록종으로 A. modesta와 A. rimosa의 종 특징을 기술하였고, 한국명이 존재하지 않는 2종에 대해서 신칭하였다. 더불어 이 절에 속한 8종에 대해 종분류검색표를 작성하였다. Lepidella 절에 속한 종으로서는 비탈광대버섯 A. abrupta, 백황색광대버섯 A. alboflavescens, 흰오뚜기광대버섯 A. castanopsidis, 잿빛사마귀광대버섯 A. griseoverrucosa, 구근광대버섯 A. gymnopus, 갈색돌기광대버섯 A. hongoi, 긴뿌리광대버섯 A. japonica, 환문광대버섯(신칭) A. kotohiraensis, 흰가시광대버섯 A. virgineoides가 확인되었다. 미기록종으로 A. griseoverrucosa, A. hongoi, A. kotohiraensis의 종 특징을 기술하였고, 9종에 대한 종분류검색표를 작성하였다. 이 중 A. griseoverrucosa는 자실체가 성숙되지 않아 담자기와 포자의 미세구조 특징을 확인하지 못하였다. Validae 절에 속한 종으로서는 애광대버섯 A. citrina, 노란대광대버섯 A. flavipes, 누더기광대버섯 A. franchetii, 잿빛애광대버섯(신칭) A. fritillaria, 붉은점박이광대버섯 A. rubescens, 노을광대버섯(신칭) A. sepiacea, 방추광대버섯 A. excelsa, 뱀껍질광대버섯 A. spissacea를 확인하였다. 미기록종으로 A. sepiacea의 종 특징을 기술하였고, 보고는 되었으나 한국명이 존재하지 않은 1종에 대해 신칭하였으며, 9종에 대한 종분류검색표를 작성하였다. 또한 Validae 절에는 기존에 특징이 보고되지 않은 2 담자기 형태의 미세구조를 보이는 신종후보종 1종을 발견하여 기술하였다.
분자계통연구를 위해 확보된 33종의 Lepidella 아속에 속하는 표본을 대상으로 각각 32종의 internal transcribed spacer (ITS) 염기서열, 30종의 nuclear large subunit rDNA (Nuc LSU) 염기서열, 23종의 RNA polymerase Ⅱ gene(rpb2) 염기서열, 23종의 β-tubulin gene 염기서열을 결정하였다. 결정된 염기서열을 바탕으로 Maximum likelihood(ML) 분석법, Maximum parsimony(MP) 분석법 그리고 Bayesian inference(BI) 분석법을 이용하여 분자계통도를 분석한 결과 형태적 분류에 따른 종은 대체로 Lepidella 아속의 4개의 절에서 분자계통학적으로 잘 구분되었다. 종간분지는 ITS 기반 분자계통도에서 분석한 것이 다른 유전자 부위보다 좀 더 명확하여 종간구분이 가능한 바코드로써의 활용이 가능한 것을 알 수 있었다. 또한 Nuc LSU, rpb2, β-tubulin 유전자 영역을 유합하여 분석한 분자계통도 결과도 ITS 영역을 기반으로 한 분자계통도와 유사한 성향을 보였다. 그렇지만 형태적으로 Phalloideae 절과 Lepidella 절에 속하는 일부 종들이 분석한 4개 유전자 영역에서 모두 분자계통도 상으로 서로 다른 분류군에 혼재되는 현상을 보였다. 이러한 결과는 기존에 연구되었던 광대버섯의 분자유전학적 계통분석 결과와 일치되는 현상이었다. 형태학적 분류와 분자계통분류간의 차이가 있는 종을 대상으로 좀 더 세심하게 형태학적 미세구조와 ITS 기반 BI분석법의 분자유전학적 결과와 비교하였다. 포자의 형태와 크기를 활용하여 미세구조를 분석한 결과, 형태적으로 Phalloideae절에 속하지만 분자계통학적으로는 Lepidella절에 혼재되었던 A. oberwinklerana, A. modest, A. pseudoporphyria등 3개 종은 Phalloideae절의 다른 종들과 포자의 형태가 다름을 확인할 수 있었다. 즉 이들 3종은 모두 구형(globose)-유구형(subglobose)의 포자형태를 지니는 Palloideae 절에 속하는 다른 종들과 달리 타원형(ellipsoid)-광타원형(broadly-ellipsoid)의 포자 형태를 가지고 있었다. 이는 Lepidella 절의 종들과 포자형태면에서는 일치함을 보여주었다.. 또한, 형태적으로는 Lepidella 절에 속하면서 하나의 독립된 분자유전학적 그룹을 형성한 A. alboflavescens의 경우는 타원형-광타원형의 포자형태인 다른 종들과 달리 반원통형(subcylindrical)의 형태를 가지고 있었다. 이 포자형태는 Lepidella 아속의 확인된 종들 중에서는 유일하기 때문에 독립적인 분자유전학적 그룹을 형성한 결과와 일치하였다. A. griseoverrucosa의 경우는 추가적인 연구가 필요하였다.
형태적으로 A. virosa와 유사한 백색계열의 버섯 표본 51개를 형태학적 관찰과 분자유전학적 동정을 통해 확인한 결과, A. virosa 1점, A. oberwinklerana 20점, A. pallidorosea 25점, A. rimosa 5점으로 확인 되었으며, 형태적으로 유사종이면서 국내에 보고된 A. verna의 경우는 확인되지 않았다. 4종은 모두 인체에 치명적인 아마톡신(amatoxin)을 생산할 수 있는 것으로 확인되었다. 이에 따라 ITS 영역을 기반으로하여 이들 4종에 특이적인 PCR 분자마커를 각각 제작하였다. A. virosa는 Avirosa-F/Avirosa-R primer set으로 113 bp에서 특이적으로 확인되었으며, 10 pg 수준에서 까지 검출 가능하였다. A. pallidorosea는 Apallidor-F/Apallidor-R primer set으로 443 bp에서 특이적으로 확인되었으며, 1 pg 수준에서 까지 검출 가능하였다. A. oberwinklerana는 Aoberw-F/Aoberw-R primer set으로 282 bp에서 특이적으로 확인되었으며, 100 pg 수준에서 까지 검출 가능하였다. 끝으로 A. rimosa는 Arimos-F/Arimos-R primer set으로 184 bp에서 특이적으로 확인되었으며, 1 pg 수준에서 까지 검출 가능하여 이들 4 종 독버섯을 구분하기 위한 분자마커로써의 활용가능성을 제시하였다.

Taxonomically, the genus Amanita belongs to Amanitaceae, Agaricales, Basidiomycota. Most of Amanita mushroom have symbiotic relationships with plants as ectomycorrhizae and do important role in forest ecology. In addition, the genus includes edible species and toxic species. Thus, peoples are interested in the genus. Since most of Amanita species are uncultivable and/or artificially not culturable and DNA extraction from dried Amanita specimens is recalcitrant, taxonomic and molecular phylogentic studies on Amanita have not much been performed. The subgenus Lepidella which is one of two subgenera in Amanita genus includes ectomycorrhizal symbiotic mushroom and toxic species. The study of this thesis was performed to classify morphologically and molecular phylogenetically Amanita mushrooms belonging to the subgenus Lepidella which were collected in Korea and to establish taxonomic system for the classified species. This study was also aimed to design and develop molecular diagnostic makers for four toxic Amanita species in Korea that could help find the cause of problematic toxic Amanita species when it was consumed by somebody.
Literature and specimens regarding 32 domestically reported Amanita species belonging to Amidella, Phalloideae, Lepidella, and Validae sectors in the subgenus Lepidella were reviewed and analyzed. The taxonomic status of 29 species was morphologically confirmed in this study. The confirmed species were 3 species (A. volvata, A. neo-ovoidea, and A. curtipes) in Amidella, 8 species (A. fuliginea, A. modesta, A. pallidorosea, A. pseudoporphyria, A. subjunquillea, A. virosa, A. oberwinklerana, and A. rimosa) in Phalloideae, 9 species (A. abrupta, A. alboflavescens, A. castanopsidis, A. griseoverrucosa, A. gymnopus, A. hongoi, A. japonica, A. kotohiraensis, and A. virgineoides) in Lepidella, and 9 species (A. citrina, A. flavipes, A. franchetii, A. fritillaria, A. rubescens, A. sepiacea, A. excelsa, and A. spissacea) in Validae sector, respectively. Among the 3 confirmed species in Amidella, A. curtipes was found to be undescribed species in Korea. Thus, its taxonomic description was given and its Korean name was coined as Hwaseong-al-kwangdae-buseot (화성알광대버섯). Taxonomy keys for these three species in Amidella were made. Among the 8 confirmed species in Phalloideae, A. modesta and A. virosa, were described as two undescribed species in Korea with their Korean names, Hoesaek -kwangdae-buseot (회색광대버섯) and Yongmun-kwangdae- buseot (용문광대버섯), respectively. In addition, Korean names were also given for A. oberwinklerana as Heen-al-kwangdae-buseot-Ajaebi (흰알광대버섯아재비) and for A. pallidorosea as Jangmei-kwangdae-buseot (장미광대버섯), repectively. Taxonomy keys for the 8 species in Phalloideae were made. Among the 9 confirmed species in Lepidella, A. griseoverrucosa, A. hongoi, and A. kotohiraensis were found to be undescribed species in Korea. Thus, their taxonomic description was given but the fruitbody of A. griseoverrucosa was not fully developed, microstructure of its basidium and basidipspores were not confirmed. A. kotohiraensis was named in Korean as Hwanmun-kwangdae-buseot (환문광대버섯). Taxonomy keys for the 9 species in Lepidella were provided. Among the 9 confirmed species in Validae, A. sepiacea (Noeul-kwangdae-buseot, 노을광대버섯) in Korean was described as undescribed species in Korea. Korean name, Jetbiet-ae-kwangdae-buseot (잿빛애광대버섯) was given to A. fritillaria and taxonomy keys for the 9 species in Validae were described. A new species candiate with two basidia shape was described within Validae sector.
To perform molecular phylogenetic study, nucleotide sequences of 33 species of mushroom specimens belonging to the subgenus Lepidella were analyzed. As the results, nucleotide sequences were successfully determined from 32 species of internal transcribed spacer (ITS), 30 species of the nuclear large subunit rDNA (Nuc LSU), 23 species of RNA polymerase Ⅱ gene(rpb2), and 23 species of β-tubulin gene. Phylogentic analysis was performed based on the determined sequences using maximum likelihood (ML), maximum parsimony (MP), and bayesian inference (BI) methods. The morphology-based classification of four sectors in the subgenus Lepidella was generally supported by the Phylogenetic analysis results. The ITS-based phylogram more clearly resolved species relationships than phylogams based on Nuc LSU, rpb2, and β-tubulin gene, showing ITS is more suitable for baecode of species in the subgenus Lepidella. The phylogram made by combined sequences of Nuc LSU, rpb2, and β-tubulin gene was similar to the ITS-based phylogram. However, some species which were morphologically belonging to the Phalloideae and Lepidella sectors were not clearly grouped with other species in the two sectors. These results conformed the previously researched phylogenetic analysis of amanita mushroom. Further comparative analysis between microstructure including spore shape and size and ITS-based phylograms obtained by BI method was done against the species which were not agreed by morphology and phylogenetic analysis. The spore shape of oberwinklerana, A. modest, and A. pseudoporphyria which belonged morphologically to Phalloideae but phylogenetically belonged to Lepidella, differed from that of other species in Phalloideae. These three species had globose to subglobose form but other species in Palloideae had ellipsoid to broadly-ellipsoid form. These results showed that the spore shape of oberwinklerana, A. modest, and A. pseudoporphyria was similar to that of species in Lepidella. Regarding A. alboflavescens which morphologically belonged to Lepidella but phylogenetically separated as an independent group, had subcylindrical form which was unique in Lepidella that had ellipsoid to broadly-ellipsoid form. These results showed that the phylogenetic analysis indicated some differences in microstructure of species within a sector or among sectors in the subgenus Lepidella. In case of A. griseoverrucosa, further work is needed with matured fruitbody specimen.
A. virosa (one specimen), A. oberwinklerana (20 specimens), A. pallidorosea (25 specimens), and A. rimosa (one specimen) were identified from whitish 51 specimens which were collected in Korea and morphologically similar to A. virosa. But A. verna which was reported in Korea and morphologically similar to A. virosawas not found. Because A. virosa, A. oberwinklerana, A. pallidorosea, and A. rimosa were confirmed as amatoxin producers, species -specific PCR markers were designed based on ITS sequence and tested by PCR. Avirosa-F/Avirosa-R primer set specifically amplified 113 bp band at the level of 10 pg from A. virosa genomic DNA and Apallidor-F/Apallidor-R primer set specifically amplified 443 bp band at the level of 1 pg from A. pallidorosea genomic DNA. A. oberwinklerana- specific 282 bp band was amplified using Aoberw-F/Aoberw-R primer set at the level of 100 pg and A. rimosa-specific Arimos-F/Arimos-R primer set successfully amplified a target 184 bp at the level of 1 pg. It is expected that the four primer sets would be used as useful molecular markers for the differentiation of the four toxic Amanita species.