RAW264.7 세포에서 방사선육종 차조기 잎의 Chloroform 분획물에 대한 항염증 효과 :Anti-inflammatory Effects of Chloroform Soluble Fraction from Perilla frutescens Britton Leaves Produced by Radiation Breeding in RAW264.7 Cells

조윤호

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자료유형: 학위논문

저자정보: 조윤호 (충북대학교, 충북대학교 대학원)

지도교수: 이준수

발행연도: 2016

저작권: 충북대학교 논문은 저작권에 의해 보호받습니다.

이용수6

이 논문의 연구 히스토리 (2)

2016

RAW264.7 세포에서 방사선육종 차조기 잎의 Chloroform 분획물에 대한 항염증 효과

조윤호 축산원예식품공학부 2016.01 학위논문

2015

방사선육종 약용들깨 추출물의 항염증 효과 연구

조윤호 , 소양강 , 남보미 외 4명 한국식품영양과학회 학술대회발표집 2015.08 학술대회자료

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본 연구는 방사선육종 돌연변이 차조기 용매별 분획물의 항염증 효과에 대해 조사하였다. 차조기는 80% methanol로 추출을 한 뒤 hexane, chloroform, ethyl acetate, butanol 순으로 분획하였다. 각 분획물을 50 μg/mL농도에서 nitric oxide (NO)와 세포독성실험을 하였다. 용매별 분획물 중, chloroform 분획물은 세포독성이 적고 NO 생성 억제효과가 가장 높게 나타내었다. 또한 chloroform 분획물은 염증성 사이토카인인 tumor necrosis factor-α (TNF-α), interleukin-6 (IL-6), monocyte chemoattractant protein-1 (MCP-1), interferon-β (IFN-β)의 생성에 가장 높은 억제효과를 나타내었다. 이후 LPS자극을 받은 RAW264.7 세포에서 chloroform 분획물에 의한 NO 생성저해가 inducible nitric oxide synthase (iNOS)발현 억제에 의한 것인지 알아보기 위해 RT-PCR과 western blot을 실시하였다. LPS로 자극된 RAW264.7 세포에서 chloroform 분획물에 의한 iNOS의 mRNA와 단백질 발현이 억제되었다. 또한, LPS로 자극된 RAW264.7 세포에서 chloroform 분획물에 의해 nuclear factor-κB (NF-κB)의 활성이 억제되었다. 그 결과, chloroform 분획물이 NF-κB를 불활성화시켜 iNOS 발현을 억제시키는 것을 알 수 있었다. 마지막으로 chloroform 분획물에서 항염증 효과를 보이는 성분을 알아보기 위해 16개의 소분획으로 나누었다. chloroform 분획물은 NMR과 HPLC를 통해 corosolic acid를 구조동정 하였다. 위의 실험결과에서 방사선육종 돌연변이 차조기의 chloroform 분획물은 LPS로 자극된 RAW264.7 세포에서 NF-κB를 불활성화를 통해 iNOS의 발현을 억제하여 NO 생성을 저해시켰다. 따라서 chloroform 분획물은 다른 용매별 분획물에 비해 항염증 효과가 있음을 알 수 있었다

In this study, anti-inflammatory effect of each solvent fractions of a mutant Perilla frutescens Britton produced by radiation breeding was analyzed. After extracting with 80% methanol, P. frutescens was fractionated in the order of hexane, chloroform, ethyl acetate and butanol. Nitric oxide (NO) and cytotoxicity experiment were conducted for each fraction under the concentration of 50 μg/mL. Among the solvent fractions, the chloroform fraction showed less cytotoxicity and the highest NO production inhibitory effect under the concentration of 50 μg/mL. Also, chloroform fraction had the highest inhibition rate on generating tumor necrosis factor-α (TNF-α), interleukin-6 (IL-6), monocyte chemoattractant protein-1 (MCP-1), and interferon-β (IFN-β), which are inflammatory cytokines. After that, RT-RCR and western blot were carried out to observe whether NO production inhibition by chloroform fraction in LPS stimulated RAW264.7 cells were caused by inhibition of inducible nitric oxide synthase (iNOS) expression. The chloroform fraction suppressed mRNA and protein levels of iNOS in LPS stimulated RAW264.7 cells. Also, nuclear factor-κB (NF-κB) activation was reduced by chloroform fraction in LPS stimulated RAW264.7 cells. It was found that suppression of iNOS expression by chloroform fraction was due to the NF-κB inactivation. Finally, in order to isolate single compound showing anti-inflammatory effect in chloroform fraction, it was devided into 16-subfractions. After that, identification of corosolic acid in chloroform fraction was conducted using NMR and HPLC. Taken together, chloroform fraction from radiation breeding mutant P. frutescens inhibited NO production in LPS stimulated RAW264.7 cells through the suppression of iNOS expression and inactivation of the NF-κB. Therefore, chloroform fraction had more strongly anti-inflammatory effect compared with other solvent fraction.

#Perilla frutescens Britton #Radiation breeding #Anti-inflammation

Ⅰ 서론 1
1. 차조기 (Perilla frutescens Britton) 1
2. 방사선육종 (Radiation Breeding) 3
2. 염증 (Inflammation) 5
3. 실험목적 9
II 재료 및 방법 10
1. 시약 10
2. 차조기 추출 및 분획 11
3. 세포 배양 13
4. 세포 생존율 14
5. NO (nitric oxide)측정 15
6. Total protein 추출 16
7. Western blot 17
8. Total RNA 추출 18
9. Real Time PCR을 이용한 iNOS mRNA 발현 19
10. ELISA assay 20
11. Luciferase analysis 21
12. 통계분석 21
Ⅲ. 결과 22
1. Lipopolysaccharide (LPS)로 자극된 RAW264.7 세포에서 용매별 분획물의 세포독성과 nitric oxide (NO) 생성 저해효과 22
2. Lipopolysaccharide (LPS)로 자극된 RAW264.7 세포에서 용매별 분획물의 염증성 사이토카인 생성 저해효과 24
3. Lipopolysaccharide (LPS)로 자극된 RAW264.7 세포에서 chloroform 분획물의 세포독성과 nitric oxide (NO) 생성 저해효과 27
4. Lipopolysaccharide (LPS)로 자극된 RAW264.7 세포에서 chloroform 분획물의 inducible nitric oxide synthase (iNOS) 발현 저해효과 29
5. Lipopolysaccharide (LPS)로 자극된 RAW264.7 세포에서 chloroform 분획물의 염증성 사이토카인 생성 저해효과 31
6. Lipopolysaccharide (LPS)로 자극된 RAW264.7 세포에서 chloroform 분획물의 nuclear factor-κB (NF-κB) 활성억제 효과 33
7. Lipopolysaccharide (LPS)로 자극된 RAW264.7 세포에서 chloroform 소분획물의 세포독성과 nitric oxide (NO) 생성 저해 효과 35
8. 활성성분 분리 및 구조분석 37
Ⅳ. 고찰 40
요약 43
Ⅴ. 참고문헌 44

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