Analysis of Organ-specific and Alternatively Spliced Transcripts Using Oligomer Microarray and RNA-Seq in Rice :벼 마이크로어레이와 RNA-Seq을 이용한 선택적 스플라이싱 및 기관 특이적 전사체 분석

채송화

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자료유형: 학위논문

저자정보: 채송화 (명지대학교, 명지대학교 대학원)

지도교수: 남백희

발행연도: 2018

저작권: 명지대학교 논문은 저작권에 의해 보호받습니다.

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이 논문의 연구 히스토리 (2)

2018

Analysis of Organ-specific and Alternatively Spliced Transcripts Using Oligomer Microarray and RNA-Seq in Rice

채송화 생명과학정보학과 2018.01 학위논문

2017

Analysis of Genes with Alternatively Spliced Transcripts in the Leaf, Root, Panicle and Seed of Rice Using a Long Oligomer Microarray and RNA-Seq

채송화 , 김정숙 , 전경미 외 4명 Molecules and Cells 2017.10 학술저널

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벼의 주요형질은 벼의 생육과 발달에 따라 발현되는 유전자에 의하여 조절된다. 이러한 유전자의 발현은 유전자의 기능에 따라 항시 발현, 기관특이적 발현, 외부환경에 의한 유도 발현 등의 양상으로 나누어 진다. 이러한 발현양상의 분석은 주요형질에 관여하는 유전자의 동정과 이에 관여하는 유전자의 상호작용을 이해하는 데 필수적이다. 마이크로어레이와 RNA-Seq 분석기법은 최근 개발된 분석 방법으로 한 조직내의 발현 유전자의 전사체 분석이 가능하게 함으로서, 생물의 성장 발달 과정에 관여하는 유전자발현 양상의 분석이 가능하다. 우리는 국내 보급품종인 동진벼의 7 가지조직인 캘러스, 재분화 캘러스, 발아 종자, 잎, 뿌리 및 꽃 (수분 전후)의 전사체를 3’-ORF 마이크로어레이를 이용하여 분석하였다. 전사체는 조직별로 얻어진 발현값을 이용하여, 여기서 얻어진 변동계수 (CV, 표준 편차의 평균값에 대한 비율)를 구하였으며, 이를 발현양상의 지표로 활용하고자 실험을 수행하였다. 변동계수의 값에 따라 유전자의 발현을 기관 특이적 (CVI), 특이적 (CVII) 및 항시 발현 (CVIII) 군으로 분류하였다. 기관 특이적 프로모터의 검정을 위하여 해당 유전자의 프로모터를 분리하고, 이를 표지유전자 발현을 식물체내에서 검증하였다. 그 결과 Os01g0702500, Os11g0211800 및 Os01g0257300 프로모터가 각각 캘러스, 발아 종자 및 뿌리에서 기관특이적으로 발현하는 것을 관찰하였다. Os08g0546300 프로모터는 꽃밥, 꽃가루, 그리고 작은 껍질과 같은 성숙한 꽃의 다양한 기관에서 도입 유전자가 발현되었지만, Os03g0369100 프로모터는 꽃밥에서만 활성화되었다. 마지막으로, Os09g0553100 프로모터는 모든 기관에서 높은 수준의 리포터 유전자 발현을 보였다. 이 결과로 보아 변동계수는 마이크로어레이로부터 얻어진 유전자 발현 데이터는 유전자의 발현양상을 분류하는데 효과적으로 활용할 수 있음을 알 수 있었다. 따라서 변동계수는 기관 및 조직의 세분을 통한 후속 프로파일링은 적절한 프로모터를 찾는데 더 효율적이라고 볼 수 있다.
Pre-mRNA 스플라이싱은 진화를 통해 얻은 단백질 다양성을 더욱 증가시킨다. 이 현상에 대한 근본적인 이유는 아직 유전자 발현의 측면에서 알려지지 않았다. 이러한 유전자의 발현과 스플라이싱의 연관현상을 관찰하고자 선택적 스플라이싱 전사 검출 마이크로어레이 (ASDM) 를 제작하여 실험을 수행하였다. 일미벼 4 가지 대표 기관인 잎, 뿌리, 1cm 단계의 어린 꽃과 수분 후 21일 이후 어린 종자를 가지고 ASDM) 및 RNA-Seq을 이용하여 전사체를 분석하였다. 마이크로어레이와 RNA-Seq에서 얻은 데이터를 비교하면 높게 발현되는 유전자에 대해서 종 모양의 분포와 연관관계를 볼 수 있었다. 항시발현 그룹에 대해 선택적 스플라이싱된 전사물내 유전자좌 부분의 지수(IAST)가 높게 관찰되었다. 매우 특이적인 그룹의 유전자는 기관 특이성을 보였으며, 선택적 스플라이싱 전사물은 동일한 기관 특이성 또는 더 적은 기관 선호도를 보였고, ''기관 특이성''을 피하는 경향이 있었다. 또한, 유전자좌 내에서, 더 긴 발현 서열은 CDS (coding sequence)가 긴 전사체에서 발견되었고, 스플라이싱된 인트론은 확장된 CDS를 위한 가장 흔한 선택적인 스플라이싱 유형이었다. 따라서, pre-mRNA 스플라이싱은 기관 선호도 및 다중도 측면에서 최대 기능을 유지하도록 진화되고 있음을 시사하고 있다.

The major traits of rice are regulated by genes expressed according to the growth and development of rice. Expression of these genes is classified into constitutive expression, organ specific expression, induction expression by external environment depending on gene function. Analysis of these expression patterns is essential for understanding the genes involved in major traits and the interaction of genes involved in them. The microarray and RNA-Seq analysis techniques can be used to analyze transcripts of genes in a tissue, and thus to analyze the expression patterns of genes involved in the developmental process of organisms. Here, we analyze the transcriptome of 7 tissues or organs of Oryza sativa L. cv. Dongjin, callus, regenerating callus, germinating seed, leaf, root, and flower (before and after pollination), using a rice 3′ ORF tilling microarray. The coefficient of variation (CV, the ratio of the standard deviation to the mean values) to the mean of microarray intensities was used to distinguish between organ-specific and constitutively expressed genes. Accordingly, classified to the degree of organ enrichment using a CV: highly variable (CVI), variable (CVII), and constitutive (CVIII) groups. To isolate organ-specific promoters, several genes were selected and validated in planta using reporter gene analysis. We found that the Os01g0702500, Os11g0211800, and Os01g0257300 promoters to be active in calli, germinating seeds, and roots, respectively. The Os08g0546300 promoter was able to drive transgene expression in various organs of mature flowers, such as the anther, lemma, and palea, whereas the Os03g0369100 promoter was only active in the anther. Lastly, the Os09g0553100 promoter induced high levels of reporter gene expression in all organs. As a result, the coefficient of variation indicates that the gene expression data obtained from the microarray can be used effectively to classify the expression patterns of genes. Thus, it can be seen to be more efficient in identifying the appropriate promoter for subsequent profiling through the subdivision of organ and tissue.
pre-mRNA splicing further increases protein diversity acquired through evolution. The underlying driving forces for this phenomenon are unknown, especially in terms of gene expression. In order to observe the relationship between the expression of these genes and the splicing phenomenon, we conducted an experiment by designing a rice alternatively spliced transcript detection microarray (ASDM). We analyzed to differentiate the transcriptome of 4 representative organs of Oryza sativa L. cv. Ilmi: leaves, roots, 1-cm-stage panicles and young seeds at 21 days after pollination using ASDM and RNA-Seq. Comparison of data obtained by microarray and RNA-Seq showed a bell-shaped distribution and a co-lineation for highly expressed genes. A higher index of the portion of loci with alternatively spliced transcripts in a group (IAST) value was observed for the constitutive group. Genes of the highly variable group showed the characteristics of the examined organs, and alternatively spliced transcripts tended to exhibit the same organ specificity or less organ preferences, with avoidance of ‘organ distinctness’. In addition, within a locus, a tendency of higher expression was found for transcripts with a longer coding sequence (CDS), and a spliced intron was the most commonly found type of alternative splicing for an extended CDS. Thus, pre-mRNA splicing might have evolved to retain maximum functionality in terms of organ preference and multiplicity.

#Rice #spliced transcript detection microarray #transcriptome #GUS staining #벼 마이크로어레이 #RNA-Se #스프라이싱

List of Figures v
List of Tables viii
Abbreviations ⅸ
Abstract ix
Background xiii
Chapter 1 Analysis of representative organ-specific genes and promoters of rice using a 3’ ORF-oriented long oligomer microarray 1
Introduction 2
Materials and Methods 6
1.1. Plant materials and RNA isolation 6
1.2. Microarray analysis 6
1.3. GoMiner analysis 8
1.4. Semi-quantitative RT-PCR 9
1.5. Plasmid construction and transformation procedures 9
1.6. Analysis of GUS gene expression 10
Results 15
1.1. Coefficient of variation analysis reveals common and specific gene groups among 7 organs or tissues of rice 15
1.2. Highly variable gene groups represent each organ 23
1.3. Semi-quantitative polymerase chain reaction shows highly variable or constitutive gene groups among organs 38
1.4. Organ specificity in planta by GUS expression using gene-specific promoters 44
Discussion 48
1.1. Higher coefficients of variation are associated with organ specificity 48
1.2. Transcription factors belong to organ-specific groups 49
1.3. Constitutively expressed genes among representative organs 52
1.4. In planta GUS staining confirms the organ/tissue specificity by microarray analysis 53
1.5. The implication and usefulness of the minimal representative organ data set of rice 55
References 57
Chapter 2 Analysis of Genes with Alternatively Spliced Transcripts in the Leaf, Root, Panicle and Seed of Rice using a Long Oligomer Microarray and RNA-Seq 67
Introduction 69
Materials and Methods 72
2.1. Plant materials and RNA isolation 72
2.2. Microarray design 72
2.3. Microarray analysis 73
2.4. Gene Ontology (GO) analysis 74
2.5. RNA sequencing 75
2.6. Data processing 75
2.7. Reverse transcription PCR (RT-PCR) and real-time PCR 76
Results 81
2.1. Target probes were designed based on unique sequences among alternatively spliced transcripts 81
2.2. Confirmation of organ preferential genes with alternative splicing transcripts 86
2.3. Genome-wide comparison of rice ASDM and RNA-Seq suggest co-linearity between the two technologies 95
2.4. Application of rice ASDM and RNA-Seq technologies to distinguish between genes that are enriched in organs and those that are constitutively expressed across organs 102
2.5. Hierarchical clustering of genes with a single transcript and alternatively spliced transcripts 109
2.6. The portion of genes with alternatively spliced transcripts is increased among genes that are constitutively expressed across organs 118
2.7. A transcript confers organ preference in a locus, and the alternatively spliced transcript(s) confers the same preference or reduced organ specificity 122
2.8. A longer CDS transcript among alternatively spliced transcripts at a locus tends to be more expressed 124
Discussion 133
2.1. ASDM and RNA-Seq provide similar GO profiles for the transcripts, as based on CV values 134
2.2. Constitutively expressed genes are under greater alternative splicing pressure 136
2.3. Alternatively spliced transcripts do not show a distinct preference of organ 138
2.4. Among alternatively spliced transcripts, those with a longer CDS show higher expression 140
References 143
Korean abstract 152

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