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논문 기본 정보
- 자료유형
- 학위논문
- 저자정보
- 지도교수
- 하배진
- 발행연도
- 2018
- 저작권
- 신라대학교 논문은 저작권에 의해 보호받습니다.
이용수3
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본 연구에서는 다양한 생리활성을 나타내는 한천분해산물을 생산할 수 있는 한천분해효소를 생산하는 해양세균을 바닷물에서 분리하고, 분리된 해양세균의 한천분해효소유전자의 염기서열 파악과 재조합발현을 수행하였으며, 정제된 한천분해효소의 특성을 파악하고 분해산물을 확인하였다. 경상남도 남해군 미조면의 바닷물에서 한천을 분해시키는 효소인 agarase 활성을 나타내는 해양세균을 분리하였고, 16S rDNA 분석을 통해 Simiduia 속에 속하는 균주임을 확인하였으며 Simiduia sp. SH-4로 명명하였다. Simiduia sp. SH-4를 배양한 후 제조된 조효소액을 이용하여 agarase의 특성을 조사하였다. Simiduia sp. SH-4 agarase의 최적활성은 30℃, 20 mM Tris/HCl (pH 6.0) 완충용액에서 120.4 U/L이었다. 또한 TLC를 통해 agarase가 neoagarobiose (39.4%)와 neoagarotetraose (60.6%)를 생산하는 β-agarase임을 확인하였다. 이후 Simiduia sp. SH-4 유래 β-agarase를 암호화하는 유전자를 클로닝하고 DNA 염기서열을 결정하였다. 유전자의 전체길이는 1,809 bp이며, 602개의 아미노산(66.2 kDa)을 암호화하고 있다. DNA 염기서열로부터 유추된 아미노산서열은 Simiduia agarivorans의 β-agarase와 74%의 상동성을 보여 glycosyl hydrolase family 16에 속하는 효소이라는 것을 확인할 수 있었다. 신호 펩티드(signal peptide)를 제외한 577 아미노산(63.5 kDa)의 성숙(mature) 단백질에 해당하는 β-agarase 유전자를 재조합 발현시켰다. 생산된 β-agarase는 chitin beads column으로 정제하였고, 정제된 효소의 최대활성은 50℃, 20 mM Tris/HCl (pH 6.0) 완충용액에서 505.07 U/mg으로 확인되었다. 재조합 β-agarase는 녹아있는 아가로스(agarose)를 가수분해하여 neoagarotetraose (57%)와 neoagarohexaose (43%)를 생산하는 것을 TLC로 확인하였으며, 30-50℃에서 녹이지 않은 한천(agar) 및 아가로스 분말에서도 생성물을 생성하는 것을 확인하였다. 따라서 Simiduia sp. SH-4 유래 β-agarase는 한천 및 아가로스로부터 neoagarotetraose 및 neoagarohexaose의 산업적인 생산에 사용될 수 있을 것으로 기대한다.
목차
제1장 서 론 1제2장 Simiduia sp. SH-4 조효소액을 이용한 β-agarase의 특성조사 3제1절 재료 및 방법 31. 균주분리 및 조효소액의 제조 31) 균주분리 32) 조효소액의 제조 42. Simiduia sp. SH-4 조효소액의 agarase 활성 41) 배양시간별 생장 및 agarase 활성 42) 온도, pH별 agarase 활성 및 열안정성 53) 아가로스 분해산물의 thin-layer chromatography (TLC) 분석 54) Zymogram 6제2절 결과 및 토의 71. 균주분리 72. Simiduia sp. SH-4 조효소액의 agarase 활성 91) 배양시간별 생장 및 agarase 활성 92) 온도, pH별 agarase 활성측정 및 열안정성 103) 아가로스 분해산물의 thin-layer chromatography (TLC) 분석 134) Zymogram 14제3장 Simiduia sp. SH-4 유래 β-agarase 유전자의 클로닝, 발현 및 특성조사 15제1절 재료 및 방법 151. 유전자 확보 및 클로닝 151) LA-PCR을 이용한 β-agarase 유전자 확보 152) 발현 vector의 제작 203) 재조합 β-agarase의 발현 및 정제 202. Simiduia sp. SH-4 유래 재조합 β-agarase의 활성 231) 재조합 β-agarase의 온도, pH별 활성 및 열안정성 232) 재조합 β-agarase에 의한 아가로스 분해산물의 생성물의 thin-layer chromatography (TLC) 233) 재조합 β-agarase를 이용한 한천 및 아가로스 분말의 분해 244) 재조합 β-agarase의 금속 및 환원제 의존성 24제2절 결과 및 토의 251. 유전자 확보 및 클로닝 251) LA-PCR을 이용한 β-agarase 유전자 확보 252) 발현 vector의 제작 283) 재조합 β-agarase의 발현 및 정제 302. Simiduia sp. SH-4 유래 재조합 β-agarase의 활성 321) 재조합 β-agarase의 온도, pH별 활성 및 열안정성 322) 재조합 β-agarase에 의한 아가로스 분해산물의 생성물의 thin-layer chromatography (TLC) 353) 재조합 β-agarase를 이용한 한천 및 아가로스 분말의 분해 374) 재조합 β-agarase의 금속 및 환원제 의존성 38제4장 결 론 40참고문헌 42Abstract 45감사의 글 47
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