영지버섯 균사 추출물이 인간 유래 멜라닌 생합성 세포에 미치는 영향 및 전사체 기반 유전자 발현 분석 :Effects of Ganoderma lucidum mycelial extract on human melanocyte(HEMn) and transcriptome-based global gene expression analysis

김홍일

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자료유형: 학위논문

저자정보: 김홍일 (건국대학교, 건국대학교 대학원)

지도교수: 박영진

발행연도: 2018

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이 논문의 연구 히스토리 (2)

2018

영지버섯 균사 추출물이 인간 유래 멜라닌 생합성 세포에 미치는 영향 및 전사체 기반 유전자 발현 분석

김홍일 응용생명과학과 2018.01 학위논문

2017

헛개나무 추출물이 첨가된 영지버섯균사 추출물의 멜라닌 생성 억제효과

김홍일 , 정용운 , 김종현 외 4명 대한화장품학회지 2017.01 학술저널

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영지버섯의 자실체 및 균사체는 만성 간 질환, 면역조절, 혈압조절과 혈당 강하 및 항종양 효과등 다른 버섯류에 비해 다양한 생리적 활성이 있다. 본 연구에서는 영지버섯 균사체 추출물의 인간 유래 멜라닌 생합성 세포에 미치는 영향 및 이와 관련된 유전자들의 발현 분석을 수행하였다. 멜라닌은 타이로신을 기질로 하여 멜라노사이트에서 생산되는데, 이는 피부와 모발의 색을 결정하는 중요한 인자이다. 타이로시나아제 (EC 1.14.18.1) 는 멜라닌 생합성에 관여하는 핵심 효소이다.
본 연구에서 인간 유래 멜라닌 생합성 세포에서의 영지2호 (Yeongji 2; Y2) 균사 추출물 (Y2ME) 처리에 의한 세포 생존율 평가는 25, 50, 100 및 200μg/ml의 농도에서 세포 생존율에 영향을 주지 않았다.따라서 본 연구에서 수행된 다양한 평가는 50, 100 및 200μg/ml의 농도로 수행되었다. 농도별 Y2ME의 처리에 의한 인간 유래 멜라닌 생합성 세포내 타이로시나아제 활성 및 멜라닌 생합성 억제 평가에서는 Y2ME의 농도 의존적으로 타이로시나아제 활성 및 멜라닌 생합성이 억제되었으며, 200μg/ml Y2ME 농도에서 41.89 ± 3.26%로 타이로시나아제 활성을 가장 높게 억제되었다. 또한 200μg/mL Y2ME 농도에서 55.13 ± 4.41%로 가장 높은 멜라닌 생합성 저해율을 보였다.
Western blotting을 이용하여 농도별 Y2ME 처리에 의한 melanogenesis 관련 TYR, TRP-1, TRP-2 및 MITF 단백질 발현양 분석에서 Y2ME의 농도 의존적으로 TYR, TRP-1, TRP-2, MITF 단백질 발현이 억제되었다. 농도별, 시간별 Y2ME 처리에 의한 cAMP 경로와 관련된 단백질 CREB 단백질의 인산화는 농도 및 처리 시간 의존적으로 발현이 감소하였다. MAPK 계열의 인산화 된 ERK, JNK의 발현양은 Y2ME 처리 후 30분 구간부터 유의적으로 증가하였으나, 인산화 된 p-38의 발현양도 함께 증가하였다. RNA sequencing 데이터는 trimming을 수행하고 낮은 quality의 read 및 sequence adapter를 제거하였다. Bowtie2 프로그램을 이용하여 인간의 유전체에 mapping 하였고, SAMtools 프로그램을 통해 mapping 된 read 값을 얻어냈다. 차등 발현 유전자 분석 (DE-Seq)을 통하여 Y2ME 처리에 의한 인간 유래 멜라닌 생합성 세포의 유전자 발현 분석을 수행하였다. 차등 발현 유전자 분석 결과 총 58,174개의 발현된 유전자를 얻었고, p-value < 0.05 값을 이용하여 4,369개의 유전자가 선발되었다. 최종적으로 log2 fold-change (>+1.5, <-1.5) 값을 기준으로 발현차이가 나는 516개의 유전자가 선별되었다. 516개의 선별된 유전자 중 염증성 사이토카인과 관련된 7개의 유전자 (DDX60, IFIT1, IFI44, CCL3, TRIM10, TRIM31, MATK), 피부와 관련된 5개의 유전자(RGS1, MMP1, MIA, KRTAP5-1, PYCARD) 및 질병과 관련된 7개의 유전자 (RNF43, WT1, IGSF6, NGFR, PRKAA2, APOD, SYT6)로 총 19개의 유전자가 최종 선별되었다. qRT-PCR을 통한 유전자 발현 확인 결과 실제로 염증성 사이토카인 및 피부와 관련된 유전자들의 발현이 유의성 있게 증가 및 감소하는 것을 확인하였다.
유전자 데이터베이스 기반 생물학적 기작 (GSEA) 분석에서 Y2ME 처리에 의해 활성화되는 주요 생물학적 경로는 TNF-α 및 TGF-β, interferon response 경로로 확인되었으며, 이러한 면역체계 신호전달 인자에 의해 매개된 PI3K?Akt-mTOR 및 MAPK 기작의 상관관계를 확인하였다.

The Ganoderma lucidum has a variety of physiological activities compared to other species, such as chronic liver disease, modulate the immune system, control blood pressure, control blood glucose levels, and anti tumor effect. In this study, effects of G. lucidum mycelial extract (Y2ME) on human melanocyte cells (HEMn) and global gene expression analysis.
Melanin is produced from tyrosine by epidermal melanocytes, is the main determinant of hair and skin color. Tyrosinase (EC 1.14.18.1) enzyme is the key enzyme involved in melanin biosynthesis.
In this study, determined the cytotoxic effects of Y2ME on HEMn cells treated with indicated concentrations. Concentrations of 25, 50, 100 and 200μg/ml Y2ME showed no cytotoxic effects in the MTT assay. Therefore, the HEMn cells were treated with Y2ME at concentrations of 50, 100, and 200μg/ml in subsequent experiments. Treatment with Y2ME various concentrations inhibited the tyrosinase activity and melanin synthesis of HEMn cells in a dose-dependent manner, intracellular tyrosinase activity with 200μg/ml of Y2ME was drastically inhibited 41.89 ± 3.26% and intracellular melanin synthesis with 200μg/ml of Y2ME was highly inhibited 55.13 ± 4.41%.
Effect of Y2ME on tyrosinase (TYR), tyrosinase related protein-1 (TRP-1), tyrosinase related protein-2 (TRP-2) as well as microphthalmia-associated transcription factor (MITF) expression, western blot analysis showed that Y2ME inhibited the expression of TYR, TRP-1, TRP-2 and MITF in dose-dependent manner. Effects of Y2ME on phosphorylation of cyclic adenosine monophosphate cAMP response element binding protein (CREB) in HEMn cells, treated with various concentrations of different times. The phosphorylation of CREB proteins was significantly decreased by treatment with Y2ME in the HEMn cells in a dose-dependent and time-dependent manner.
Effects of Y2ME on phosphorylation of the MAPK family proteins. The phosphorylation of ERK and JNK proteins were significantly increased after 30min, respectively, whereas phosphorylation of p-38 protein was increased in HEMn cells. RNA sequencing data were processed for further analysis by trimming low quality reads and removing sequencing adapters, mapped reads were further processed by SAMtools. In this study, performed statistical analysis using DE-Seq to establish that genes expression levels of treated Y2ME on HEMn cells. As a result of the DE-Seq analysis, a total of 58,174 genes expression were obtained, 4,369 genes were differentially expressed p-value < 0.05 in treated Y2ME cells compared to non-treated cells. Among these 4,369 genes, the expression of 516 genes were dramatically different (>+1.5 or <-1.5 log2 fold-change). Finally, 19 genes were selected, associated with inflammatory cytokines affect the differentiation, proliferation and migration of melanocytes. 7 genes (DDX60, IFIT1, IFI44, CCL3, TRIM10, TRIM31, MATK) related to inflammatory cytokines, 5 genes (RGS1, MMP1, MIA, KRTAP5-1, PYCARD) related to skin and 7 genes (RNF43, WT1, IGSF6, NGFR, PRKAA2, APOD, SYT6) related to diseases were selected, respectively. Gene expression levels were quantified by real time PCR, the analysis of expression pattern of the inflammatory cytokine and human skin related genes was significantly up- or down-regulation.
In Gene set enrichment analysis (GSEA), the major pathways activated by Y2ME treatment are TNF-α, TGF-β and Interferon response pathway, the correlation was confirmed of PI3K-Akt-mTOR and MAPK pathway machanisms mediated by these immune system signaling factors.

#인간피부 #영지버섯 #미백 #유전체 #DESeq #사이토카인

표 목 차 ............................................................................................................................... ⅳ
그림목차 .............................................................................................................................. ⅴ
ABBREVIATION ................................................................................................................... ⅷ
ABSTRACT............................................................................................................................ⅸ
제1장 인간 유래 멜라닌 생합성 세포를 이용한 영지 균사 추출물의 melanogenesis 효과....................1
제1절 서 론................................................................................................1
제2절 재료 및 방법......................................................................................7
1. 공시 균주 및 시료 준비...........................................................................7
2. 세포 배양.............................................................................................7
3. 세포 생존율 평가...................................................................................8
4. 인간 유래 멜라닌 생합성 세포주를 이용한 영지 균사 추출물의 타이로시나아제
활성 억제능 평가...................................................................................9
5. 인간 유래 멜라닌 생합성 세포주를 이용한 영지 균사 추출물의 멜라닌 생합성
저해능 평가.........................................................................................10
6. Western blot 분석...............................................................................11
7. 통계처리.............................................................................................13
제3절 결과 및 고찰.....................................................................................14
1. 영지 균사 추출물의 세포 생존율 분석.......................................................14
2. 영지 균사 추출물 처리에 따른 타이로시나아제 활성 억제 효과.....................16
3. 영지 균사 추출물 처리에 따른 멜라닌 생합성 저해 효과...............................18
4. 영지 균사 추출물 처리에 따른 인간 유래 멜라닌 세포 내 melanogenesis 관련
효소 (TYR, TRP-1, TRP-2) 및 MITF 발현 분석...........................................21
5. 영지 균사 추출물 처리에 따른 인간 유래 멜라닌 생합성 세포 내 cAMP response
element binding(CREB) 단백질 발현 분석..............................................23
6. 영지 균사 추출물 처리에 따른 인간 유래 멜라닌 생합성 세포 내 인산화 된 p-38,
c-jun N-terminal kinase(JNK) 및 extracellular signal regulated kinase (ERK)
단백질 발현 분석..................................................................................25
제2장 영지 균사 추출물 처리에 따른 인간 유래 멜라닌 세포의 전사체 분석 기반 전반적인 유전자 발현 분석....28
제1절 서 론...............................................................................................28
제2절 재료 및 방법.....................................................................................30
1. 세포 배양............................................................................................30
2. Total RNA 추출...................................................................................30
3. RNA sequencing 데이터 분석...............................................................31
4. 차등 발현 유전자 분석(DESeq)...............................................................32
5. 유전자 데이터베이스 기반 생물학적 기작 분석(GSEA) 32
6. cDNA 합성 및 quantitative real-time polymerase chain reaction
(qRT-PCR)...........................................................................................33
7. 통계처리..............................................................................................35
제3절 결과 및 고찰......................................................................................36
1. RNA-sequencing 분석 및 차등 발현 유전자 분석........................................36
2. 차등 발현 유전자 분석 데이터를 기반으로 한 핵심 유전자군의 선발................44
3. 인터페론 유도 관련 유전자(DDX60, IFIT1, IFI44) 및 면역체계의 사이토카인
신호전달 관련 유전자(CCL3, TRIM10, TRIM31, MATK)의 발현 분석............73
4. 인간 유래 멜라닌 생합성 세포의 melanogenesis 관련 유전자(RGS, MMP1,
MIA) 및 질병 관련 유전자(KRTAP5-1, PYCARD)의 발현 분석.....................77
5. 차등 유전자 발현 분석 데이터 기반 영지 균사 추출물 처리에 의한 인간의 질병과
관련된 유전자(RNF43, WT1, IGSF6, NGFR, PRKAA2, APOD, SYT6)의 발현
분석.....................................................................................................80
6. 영지 균사 추출물 처리에 의한 인간 유래 멜라닌 생합성 세포의 유전자 데이터베이스
기반 생물학적 기작 분석..........................................................................83
참고문헌...................................................................................................88
국문초록..................................................................................................101

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