본 연구에서는 대장균을 이용한 rCRM197 생산 및 재조합 효모를 이용한 목질계 바이오매스 이용에 관한 연구를 위한 유전공학적, 대사공학적 접근을 시도하였다. Cross reacting material 197 (CRM197)은 디프테리아 독소의 돌연변이 단백질로 52번째 아미노산인 glycine이 glutamate로 치환된 단백질로 디프테리아 독소의 독성이 제거되었으며, 면역 자극제의 효능은 유지된다는 특징이 있다. 이러한 특징을 활용해 면역 증강용 전달단백질로 주로 사용된다. 본 연구에서는 대장균을 이용한 recombinant CRM197 (rCRM197)의 생산을 위한 코돈 최적화 과정 및 발현벡터 개발, 그리고 이를 이용한 발현용 균주의 개발을 진행하였으며 개발한 균주를 이용한 수용성 형태의 rCRM197단백질 생산을 수행하였다. 생산 최적화 공정을 수행하기 위해 온도, 시간 그리고 IPTG 농도 등 발현속도를 조절하여 rCRM197 단백질의 수용성 형태의 rCRM197단백질의 생산량이 가장 높은 발현조건을 탐색하였으며, 이후 상업적 생산에 적용하기 위해 발효기를 이용한 scale-up을 수행하였다. 추가적으로 대장균을 이용한 rCRM197 생산성을 증진시키기 위해 불용성 상태로 발현된 단백질의 solubilization 및 refolding 과정을 수행하였다.
효모를 이용한 목질계 바이오매스 이용에 관한 연구를 위해 열 내성 효모인 K. marxianus균주를 이용한 다양한 접근을 시도하였다. 자일로스 소비 향상을 위해 mKmXYL1, KmXYL2, 그리고 KmXYL3 유전자를 과발현 시키기 위한 multi-copy integration을 수행하였으며, 자일로스 이용에 영향을 끼치는 유전자인 PHO13 및 ALD6유전자의 조작을 CRISPR/Cas9을 이용하여 시도했다. 자일로스 소비 향상을 위해 mKmXYL1 유전자가 과발현된 K. marxianus균주를 선별한 결과 모균주에 비해 자일리톨 생산성이 최대 5.4배 증진된 K. marxianus 17555-JBP2균주를 선별할 수 있었다. 선별된 균주의 xylose reductase에 관한 DNA, mRNA, enzymatic assay 분석을 수행하여 개량된 균주와 모균주의 차이를 규명하였으며, 생산성 증대를 위해 발효기를 이용한 생산조건 최적화를 수행하였다. 추가적으로 K. marxianus 17555-JBP2균주의 자일로스 소비를 더 증진시키기 위해 KmXYL2, 그리고 KmXYL3 유전자를 삽입한 결과 자일로스 소비 및 에탄올 생산성이 각각 1.60배, 6.03배 증가한 K. marxianus JBP2_XDH-2 균주를 선별할 수 있었다.
K. marxianus 균주를 이용한 3-hydroxypropionic acid (3-HP) 생산을 위해 Klebsiella pneumonia 균주의 glycerol dehydratase (GDH), Azospirillum brasilense 균주의 alpha-keto glutaric semialdehyde dehydrogenase (KGSADH) 그리고 Chloroflexus aurantiacus 균주로부터 유래한 malonyl-CoA reductase (MCR) 유전자의 염기서열 확보 및 코돈 최적화, 그리고 DNA합성 및 이를 이용한 K. marxianus균주 개량을 진행하였다. 글리세롤을 이용한 3-HP생산을 위해 GDH 및 KGSADH 발현 유전자를 K. marxianus 균주에 삽입하여 3-HP생산을 진행한 결과 선별된 균주들(17555_C1 및 JBP2_C1)이 각각 0.42 g/L, 0.43 g/L의 3-HP를 생산할 수 있음을 확인하였다. MCR 발현 유전자를 K. marxianus 17555-JBP2균주에 삽입하여 Malonyl-CoA를 이용한 3-HP생산을 위해 균주 개량을 수행하였으며 그 결과 JBP2_MCR균주를 선별하였다. JBP2_MCR균주는 자일로스를 탄소원으로 이용하여 0.1 g/L의 3-HP를 생산할 수 있었으며, malonyl-CoA를 기질로 이용할 경우 0.83 g/g의 수율로 3-HP를 생산할 수 있음을 확인할 수 있었다.

In this study, a genetic and metabolic approach was attempted to study rCRM197 production using E. coli and the use of cellulosic biomass using recombinant yeast.
Cross reacting material 197 (CRM197) is a mutant protein of diphtheria toxin. A single mutation at position 52, substituting glutamic acid for glycine. The toxicity of diphtheria toxin is eliminated, and the efficacy of the immune stimulant is maintained which is the robust advantage of CRM197 used as a delivery protein. In this study, codon optimization and expression vector development to produce recombinant CRM197 (rCRM197) using E. coli were performed. For expression of rCRM197 in the soluble form, expression temperature, time, and IPTG concentration were adjusted to achieve the higher soluble form expression. Additionally, scale-up using a fermenter was performed to apply the commercial production of rCRM197. To improve the productivity of rCRM197 using E. coli, the solubilization and refolding of proteins expressed in insoluble state were performed.
In order to study the use of cellulosic biomass, using thermotolerant yeast, K. marxianus, various approaches were attempted. To improve xylose consumption, multi-copy integrations were performed to overexpress mKmXYL1, KmXYL2, and KmXYL3 genes. In addition, manipulation of genes affecting xylose utilization (PHO13 and ALD6 genes) were attempted using CRISPR/Cas9. As a result of overexpressing the mKmXYL1 gene, the K. marxianus 17555-JBP2 strain was selected which xylitol productivity was 5.4 times improved than the parent strain. To enhancement of xylose utilization, KmXYL2 and KmXYL3 genes were overexpressed in K. marxianus 17555-JBP2 and K. marxianus JBP2_XDH-2 strains was selected which xylose consumption and ethanol productivity increased by 1.60 times and 6.03 times, respectively. For production of 3-hydroxypropionic acid (3-HP) using K. marxianus strain, heterologous DNA [glycerol dehydratase (GDH) from Klebsiella pneumonia, alpha-ketoglutaric semialdehyde dehydrogenase (KGSADH) from Azospirillum brasilense and malonyl-CoA reductase (MCR) from Chloroflexus aurantiacus were overexpressed in K. marxianus strains.