Cellobiose와 xylose를 동시 발효하는 Pichia stipitis 돌연변이 균주의 특성분석 :Characterization of mutant Pichia stipitis strain co-fermenting cellobiose and xylose

김대환

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자료유형: 학위논문

저자정보: 김대환 (전남대학교, 전남대학교 대학원)

지도교수: 이원흥

발행연도: 2021

저작권: 전남대학교 논문은 저작권에 의해 보호받습니다.

이용수5

이 논문의 연구 히스토리 (3)

2021

Cellobiose와 xylose를 동시 발효하는 Pichia stipitis 돌연변이 균주의 특성분석

김대환 융합식품바이오공학과 2021.01 학위논문

2019

Cellobiose와 xylose를 동시에 대사하는 Pichia stipitis 돌연변이를 활용한 동시당화발효

김대환 , 이원흥 KSBB Journal 2019.12 학술저널

적응진화를 활용한 cellobiose와 xylose 동시발효 Pichia stipitis의 개발

김대환 , 이원흥 한국미생물·생명공학회지 2019.01 학술저널

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섬유소계 바이오매스로부터 바이오 연료 등과 같은 유용한 물질을 생산하기 위해서는 바이오매스로부터 유래하는 혼합당을 효과적으로 대사할 수 있는 균주의 개발이 필수적이다. 본 연구에서는 자일로스(xylose)를 대사 가능한 효모인 P.
stipitis를 적응진화하여 셀로바이오스(cellobiose) 대사효율이 향상되고 cellobiose와 xylose를 동시에 대사 할 수 있는 균주를 개발하고 유전적 특성을 분석하고자 하였다. Cellobiose를 탄소원으로 하는 배양 조건에서 야생형P. stipitis CBS6054를 총 10 회 계대배양하여 cellobiose대사가 개선된 돌연변이 균주 P. stipitis YN14를 선별하였다. 이 균주는 모균주인 CBS6054에 비해 cellobiose 대사속도가 6배 이상 증가되었으며, cellobiose와 xylose 혼합당을 동시에 발효하여 모균주에 비해 2배 가까이 향상된 ethanol 생산 및 생산속도를 나타내었다. 돌연변이 균주 P.stipitis YN14의 특성을 분석하기 위해 유전체를 분석한 결과 모균주인 CBS6054와 비교하여 YN14에서 cellobiose 대사와 관련된 유전자의 유전적 변이는 관찰되지 않았다. 전사체 분석 결과 모균주와 비교하여 YN14에서 cellobiose transporter 및 intracellular β-glucosidase들(HXT2.3, BGL1 및 BGL2)의 발현수준의 현저한 증가를 확인하였고, 이는 cellobiose의 이송 및 분해에 관련된 유전자들의 발현수준의 증가가 YN14의 cellobiose 대사향상의 원인으로 판단된다. 아울러 YN14에서
세포내 전자전달계 및 ATP 합성에 관련된 유전자들인 COX17과 ATP18의 발현수준의 상당히 감소하였으며, 이는 YN14의 cellobiose 대사 흐름이 호흡을 통한 세포생장이 아닌 발효를 통한 에탄올 생성으로 전환됨을 시사한다. 아울러 두 가지
cellulose를 분해하는 효소(Celluclast 1.5L 및 Cellic CTec2)를 이용하여 cellulose 를 기질로 하는 동시당화발효(simultaneous saccharification and fermentation,SSF)를 진행하여 모균주 CBS6054와 돌연변이 YN14의 에탄올 생산을 비교하였다.돌연변이 YN14는 Celluclast 1.5L를 사용한 SSF에서 Celluclast 1.5L 및 Cellic CTec2를 이용한 모균주 CBS6054의 SSF보다 각각 1.5배 및 1.2배 높은 에탄올을 생산하였다. 또한 YN14는 cellulose와 xylose를 기질로 하여 Celluclast 1.5L를 사용한 SSCF(simultaneous saccharification and co-fermentation)에서 Celluclast 1.5L 및 Cellic CTec2를 이용한 모균주의 SSCF보다 각각 75% 및 60% 높은 에탄올을 생산하였다. 본 연구 결과는 적응진화 방법으로 구축한 돌연변이 균주 YN14 및 그 유전정보가 섬유소계 바이오매스로부터 바이오연료 및 바이오소재 생산을 위한 균주 개발에 효과적으로 활용될 수 있음을 시사한다.

In order to produce biofuels and value-added materials from cellulosic biomass, it is required to develop microbial strain capable of fermenting mixed sugars efficiently. In this study, the natural xylose fermenting yeast, Pichia stipitis, was evolved to ferment cellobiose and xylose simultaneously. Enrichmnet of P. stipitis CBS6054 in the medium with cellobiose as a sole carbon source cellobiose led to the isolation of the mutant P. stipitis YN14 strain not only fermenting cellobiose significantly faster than the parental strain but also fermenting cellobiose and xylose simultaneously. Genome analysis of the mutant YN14 strain showed that there is no mutation in the genes involved in cellobiose metabolism. However, transcriptome analysis of
the mutant YN14 strain exhibited that expression levels of the HXT2.3 gene encoding cellobiose transporter and the BGL1 and BGL2 coding for intracellular β-glucosidase were significantly increased compared with those of the parental CBS6054 strain, suggesting that increased expression levels of these genes contributed to improved cellobiose fermenting capability in YN14 strain. Transcriptome analysis of the mutant YN14 strain also revealed that expression levels of the genes involved in electron transport chain and ATP biosynthesis (COX17 and ATP18) were considerably decreased compared with those of the parental CBS6054, which suggest that metabolic flux of cellobiose was shifted from the respiration to ethanol fermentation in YN14 strain. In addition, ethanol producing capability of the mutant YN14 was compared with the that of parental strain CBS6054 in simultaneous saccharification and fermentation (SSF). In SSF of cellulose employing Celluclast 1.5L as the cellulolytic enzyme, the mutant strain produced 5.5- and 1.2-folds higher ethanol than the parental strain with Celluclast 1.5L and Cellic CTec2, respectively. Moreover, the mutant YN14 strain with Celluclast 1.5L showed 75% and 60% higher ethanol production compared with the parental CBS 6054
strain with Celluclast 1.5L and Cellic CTec2, respectively, in simultaneous saccharification and co-fermentation (SSCF) of cellulose and xylose. Our results propose that genetic information of the mutant P. stipitis cofermenting cellobiose and xylose would be utilized to develop microbial host for production of value-added materials from the cellulosic biomass

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목차
국문초록 13
Chapter I. 적응진화를 활용한 cellobiose 와 xylose 동시발효 Pichia stipitis 의 개발 16
Ⅰ. 서론 18
Ⅱ. 재료 및 방법 22
1. 균주, 적응진화 및 진화된 균주의 선별 22
2. 혼합당 발효 23
3. 진화된 효모 균주의 안정성 확인 23
4. 분석방법 24
Ⅲ. 결과 25
1. 적응진화를 통한 P. stipitis 의 cellobiose 대사의 향상 25
2. Cellobiose 대사가 향상된 P. stipitis 진화 균주의 선별 26
3. 진화된 P. stipitis 의 cellobiose 와 xylose 동시발효 28
4. 진화된 P. stipitis 의 유전적 변이의 안정성 확인 31
Ⅳ. 고찰 32
Ⅴ. 참고문헌 56
Chapter II. Cellobiose 와 xylose 를 동시에 대사하는 Pichia stipitis 돌연변이의 유전체 분석 및 전사체 분석 61
Ⅰ. 서론 64
Ⅱ. 재료 및 방법 67
1. 균주 및 배지 67
2. 유전체 분석 67
3. 전사체 분석 68
4. 분석방법 69
Ⅲ. 결과 및 고찰 70
1.YN14 균주의 유전체 분석 결과 70
2. P. stipitis YN14 전사체 분석 결과 71
Ⅳ. 결론 81
Ⅴ. 참고문헌 98
Chapter III. Cellobiose 와 xylose 를 동시에 대사하는 Pichia stipitis 돌연변이를 활용한 동시당화발효 104
Ⅰ. 서론 106
Ⅱ. 재료 및 방법 110
1. 균주 및 배지 110
2. 동시당화발효 조건 110
3. 분석방법 112
Ⅲ. 결과 및 고찰 103
1. Cellulose 의 동시당화발효 103
2. Cellulose 와 xylose 의 동시당화발효 117
Ⅳ. 결론 124
Ⅴ. 참고문헌 131
영문초록 136

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