중국남부의 벼농사는 자유 방목 오리들과 야생철새가 공존하는 서식지를 제공하였고, 그 영향으로 Gs/Gd바이러스를 포함한 고병원성 조류인플루엔자(HPAI)가 중국남부에서 빈번하게 등장해왔다. H5형 HPAI 바이러스는 대체로 통제되지 않은 가금류와 그 관련 물품의 이동에 의해 몇몇 아시아 국가와 캄보디아와 라오스 같은 그 인근국에서 풍토화 되었다. 동남아시아 국가들에서의 HPAI의 확산 패턴과는 달리, 우리나라는 몇차례의 HPAI 발생이 있었지만, 살처분 정책을 적용하여 바이러스를 근절해왔다. 야생 철새의 이동이 국내 HPAI 발생의 주요한 원인으로 여겨지므로, 정기적인 모니터링과 예찰 검사를 수행하는 것이 중요하다. 이 연구에서 우리는 국내로 새로운 HPAI 바이러스가 도입되는 것에 대비하고자, 캄보디아와 라오스에서 유행하는 HPAI 바이러스를 분리하고 그 특성을 확인하였다.
라오스는, 2004년부터 몇 차례의 H5형 HPAI의 발생을 겪어왔다. 이 연구에서 우리는 2015년에서 2018년 사이 라오스의 HPAI 가금류 발생 시료로부터 H5N1 HPAI 바이러스를 분리하였고, 그 유전적 특성과 닭에서의 병원성을 조사하였다. 계통학적 분석 결과, 분리주들은 clade 2.3.2.1c에 속하고 있었고, 과거 라오스 분리주와는 유전적 구성에서 차이가 존재했다. 특히, 분리주는 NS유전자의 차이에 근거해서 두 종류의 유전형으로 나뉘었다. 바이러스의 이동 가능성 분석 결과는 라오스 분리주들이 인근 국가, 특히 베트남에서 도입되었을 확률이 높다고 제시했다. 가장 최근 분리주인 A/Duck/Laos/NL-1504599/2018의 정맥 내 병원성 지수(IVPI)는 3.0이었고, 반수치사량은 102.5EID50/0.1ml로 높은 병원성을 나타냈다. 분리주에서 포유류 적응과 관련된 주요한 변이는 확인되지 않았지만, neuraminidase inhibitor 내성과 관련된 마커를 가지고 있었다.
캄보디아에서도, 2004년 이후로 몇차례의 HPAI가 발생하였는데, 2013년까지는 발생한 모든 H5N1 바이러스가 clade 1과 그 subclade에 속하고 있었다. 2014년 초부터 clade 2.3.2.1c에 속하는 H5N1 HPAI 바이러스가 다양한 유전형(KH1-KH5)을 나타내며 등장하였다. 우리는 2018-2019년에 캄보디아의 가금류 농장과 도축장에서 얻은 시료로부터 9개의 H5N1 HPAI바이러스를 분리하였고, 전체 유전자의 계통분석을 수행하였다. 모든 분리주는 clade 2.3.2.1c로 HA 유전자의 분절부위에서 다염기성 아미노산(PQRERRRKR/GLF)을 가지고 있었다. 계통분석 결과, 모든 분리주는 2015년 캄보디아에서 우세했던 KH2 유전형에 속하고 있었다. HA 유전자의 계통 분석에서, 분리주는 2개의 그룹(A와 B)으로 나뉘고 있었다. Bayesian discrete phylogeography 분석 결과, 베트남에서 캄보디아와 캄보디아에서 베트남의 두 바이러스 이동 경로가 높은 통계적 수치를 나타냈고, 이러한 결과는 캄보디아와 베트남 사이에 양방향으로 바이러스 전파가 지속되었음을 나타낸다. 여기에는 자유 방목 오리 시스템과 가금류 관련 물품의 이동을 포함한 몇 가지 요소들이 기여했을 것으로 여겨진다.
우리 분석 결과는 캄보디아와 라오스의 HPAI 바이러스는 중국과 베트남의 영향을 크게 받는다는 것을 보여주었다. 이러한 결과들은 H5 HPAI의 전세계적 확산에 더욱 잘 대비하고 추적하기 위해서는 라오스나 캄보디아를 포함한 동남아시아에서 유행하는 바이러스의 상시적 예찰 검사가 중요하다고 강조하고 있다.

Highly pathogenic avian influenza (HPAI) viruses, including Gs/Gd lineage, have emerged frequently in Southern China, where rice farming provides feeding habitat for both free-grazing domestic ducks as well as wild and migratory birds. The H5 HPAI virus has become endemic in several Asian countries and their near neighbors, including Laos and Cambodia, largely due to unregulated movement of poultry and poultry products. Unlike the pattern of HPAI spread in Southeast Asia, South Korea has experienced several HPAI outbreaks and has applied a stamping-out policy for eradication of the virus. Because HPAI outbreaks in Korea are thought to be caused by the migration of wild waterfowl, it is important to implement regular monitoring and surveillance. The present study describes the isolation and characterization of HPAI viruses circulating in Laos and Cambodia to prepare for the introduction of the novel HPAI virus to South Korea.
Multiple outbreaks of H5 HPAI viruses have occurred in Laos since 2004. H5N1 HPAI viruses were isolated from poultry outbreaks in Laos during 2015?2018 and their genetic characteristics and pathogenicity in chickens were investigated. Phylogenetic analysis revealed that the isolates belonged to clade 2.3.2.1c and that they differed in genetic composition from previous viruses isolated in Laos. In particular, the isolates were divided into two genotypes, each of which had a different NS segment. Migration analysis suggested a high likelihood that these isolates were introduced into Laos from neighboring countries, particularly Vietnam. One recent isolate from Laos, A/Duck/Laos/NL-1504599/2018, had an intravenous pathogenicity index score of 3.0 and showed a 50% lethal dose in chickens of 102.5 EID50/0.1 ml, indicating high pathogenicity. The isolated viruses exhibited no critical substitutions in the markers associated with mammalian adaptation, but possessed markers associated with resistance to neuraminidase inhibitors.
Several outbreaks of HPAI have been reported in Cambodia since 2004. Until 2013, all identified H5N1 viruses belonged to clade 1 and its subclades. H5N1 HPAI viruses belonging to clade 2.3.2.1c have been dominant since the beginning of 2014, with various genotypes (KH1-KH5) reported. Nine H5N1 HPAI viruses were isolated from domestic poultry farms and slaughterhouses in Cambodia during 2018?2019 and subjected to phylogenetic analysis of whole genome sequences. All isolates were classified as H5 clade 2.3.2.1c viruses and all harbored multi-basic amino acid sequences (PQRERRRKR/GLF) at their hemagglutinin (HA) cleavage site. Phylogenetic analysis revealed that these H5N1 isolates belonged to the KH2 genotype, the dominant genotype in Cambodia in 2015. Phylogenetic analysis of the HA gene showed that the isolates were divided into two groups (A and B). Bayesian discrete phylogeography analysis suggested two viral migration pathways, from Vietnam to Cambodia and from Cambodia to Vietnam, indicating that viral transmission occurred in both directions. Several factors may have contributed to this bi-directional migration, including the free-grazing duck system and the movement of poultry-related products.
Taken together, these findings indicate that HPAI viruses in Laos and Cambodia are largely affected by viruses in China and Vietnam. These results emphasize the need for ongoing international surveillance of circulating influenza virus in Southeast Asia, including Laos and Cambodia, to better prepare for and mitigate the global spread of H5 HPAI.