골관절염 환자 기원 세포의 스페로이드 공배양을 통한 골관절염 환자의 관절 내 환경 재구성 :Reconstruction of the intra-articular environment by spheroid co-culture using osteoarthritis patients-drived cells

박소현

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자료유형: 학위논문

저자정보: 박소현 (동국대학교, 동국대학교 일반대학원)

지도교수: 임군일

발행연도: 2023

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이 논문의 연구 히스토리 (2)

2023

골관절염 환자 기원 세포의 스페로이드 공배양을 통한 골관절염 환자의 관절 내 환경 재구성

박소현 재생의공학과 2023.01 학위논문

2019

소아 류마티스 관절염으로 인한 경피증에 대한 한방복합치료 증례보고 1례

박소현 , 이진용 , 이선행 외 1명 대한한방소아과학회지 2019.01 학술저널

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골관절염의 염증성 환경은 관절연골의 여러 세포들이 서로 반응하면서 이루어지는 3차원적인 환경으로, 2차원 단층배양에서 염증성 환경을 만들어 골관절염의 치료 효능을 평가하는 방법은 생체 내의 염증성 환경과는 큰 차이가 있다. 따라서 본 연구에서는 관절 내 여러 세포들의 오가노이드로 구성된 3차원 공배양 시스템을 통해 생체 내 환경을 모사하는 것을 목표로 하였으며, 인공관절 수술 후 골관절염 환자로부터 분리된 활액막 세포, 연골세포, 지방세포를 이용한 골관절염 평가 시스템을 구축하고자 하였다. 연골세포의 2차원 세포 배양 시와 세 가지 세포의 3차원 세포 공배양 시 형성된 스페로이드의 세포독성평가와 산화질소 분석을 진행하였다. 그 결과, IL-1b로 염증 반응을 유도한 48시간 후에도 2차원 배양 시와 3차원 공배양 시 세포 생존율의 차이는 없었고 3차원 공배양 시 염증성 환경에 대한 반응도가 크다는 것과 염증 관련 분비 인자들의 수치가 크게 차이 남을 확인했다. 이러한 결과를 종합하여, 본 연구에서는 3차원 공배양 시스템을 이용했을 때 실제 골관절염의 관절 환경을 유사하게 모사할 수 있음을 확인했고 차후에 골관절염 치료용 약물 테스트에 유용하게 사용될 것이라고 기대한다.

The inflammatory environment of osteoarthritis (OA) is a three-dimensional (3D) environment formed by the reaction of various cells of articular cartilage with each other. Cells administered for cartilage regeneration in OA interact with various inflammatory factors secreted from surrounding cells in this 3D environment and are affected by the mechanical factors of the joint. Therefore, the in vitro experimental method of administering inflammatory cytokines such as interleukin-1 beta (IL-1ß) to create an inflammatory environment in cells in two-dimensional (2D) monolayer culture is inevitably different from the inflammatory environment of OA in vivo. In addition, the effects of various factors affecting the survival/engraftment of cells on the administered cells can be evaluated in a 3D co-culture system composed of spheroids of intra-articular cells to better mimic the inflammatory environment of OA. In this study, a culture method using a 3D co-culture system consisting of chondrocytes, synovial cells, and adipocytes derived from OA patients was established to simulate the inflammatory environment in the joint cavity of OA patients. In addition, it was confirmed that the in vivo environment of OA could be better simulated as compared to the inflammatory environment in the 2D monolayer culture or spheroid culture of chondrocytes. In this study, we confirmed that cells from each osteoarthritis patient''s tissue can be cultured by forming spheroids in our newly designed 3D co-culture dish. Cell viability between spheroids of chondrocyte, spheroids of adipocyte and spheroids of synovial cell did not show a significant difference. However, the amount of NO synthesis was confirmed to be significantly higher in the case of spheroids of chondrocyte. Therefore, it was confirmed that the response in the inflammatory environment has a large difference depending on the tissue of origin. In addition, we confirmed that co-culture of cells isolated from the major constituent tissues of articular cartilage is required to properly simulate the inflammatory environment of OA. There is no significant difference in cell proliferation and cell viability according to the cell culture method (2D monolayer or spheroid culture) and cell type (spheroids of chondrocytes or co-culture of chondrocytes, adipocytes and synovial cell spheroids). However, it was confirmed that there was a difference between the amount of NO synthesis and the amount of secreted inflammatory cytokines (IL-6, PGE2 and MMP-13). We reconstructed the intra-articular environment of OA with spheroid from OA patient-derived cells. Comparing osteoarthritis''s inflammatory environmental response when using 2D monolayer culture, 3D spheroid culture, and 3D co-culture system confirmed that a better OA environment was formed when the 3D co-culture system was used. When using the 3D co-culture system developed in this study, it is expected that the limitations and problems of drug screening using 2D monolayer culture can be supplemented, and furthermore, the use of experimental animals can be replaced.

제1장 서 론 1
제1절 골관절염의 중요성 및 임상적 한계 1
제2절 줄기세포의 성상을 통한 연골재생의 문제점 2
제3절 오가노이드로 골관절염을 재구성한 3차원 공배양시스템의 필요성 2
제4절 연구의 중요성 3
제5절 연구의 기대 효과 4
제2장 실험 재료 및 방법 5
제1절 재료의 준비 5
제2절 인공관절수술 환자 기반 줄기세포의 획득 및 배양 5
1. 지방조직의 배양법 확립 6
2. 활액막조직의 배양법 확립 6
3. 연골조직의 배양법 확립 6
제3절 3차원 공배양 시스템을 적용하기위한 배양 접시 활용 7
제4절 골관절염 환자 기원 지방세포, 활액막세포, 연골세포의 오가노이드 3차원 배양 방법 8
1. 지방세포, 활액막세포, 연골세포의 오가노이드 3차원 배양 방법 8
2. 대조군 설정 - 단일 연골세포의 2차원 단층배양 9
3. 비교군 설정 단일 연골세포의 3차원 배양 9
제5절 MTT(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5 diphenyltetrazolium bromide) assay 10
제6절 IL-6, ADAMTS5, PGE2, MMP13 ELISA(Enzyme-linked immunosorbent assay)분석 10
제7절 Nitric Oxide 분석 11
제8절 통계 분석 11
제3장 결 과 13
제1절 골관절염 환자 기원 세포의 배양방법 확립 13
제2절 3차원 공배양 시스템을 이용한 환자 기원 세포 배양 14
제3절 3차원 공배양 시스템을 이용한 골관절염 염증성 환경 재구성 평가 14
1. 3차원 공배양 시스템 디쉬에서 형성된 각각의 스페로이드의 생존율 비교 14
2. 배양방법 및 배양세포 종류에 따른 세포 생존율 비교 16
제4장 결론 및 토의 18
참 고 문 헌 20
ABSTRACT 24

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