본 연구는 꾸지뽕나무 잎에 함유된 생리활성물질인 chlorogenic acid, rutin, isoquercitrin의 표준정량화를 위한 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC-DAD) 분석법을 확립하고자 실시하였다. 꾸지뽕나무 잎에 함유된 주요화합물은 MS/MS 분석, UV 흡광도, 물질의 유지시간 등을 통하여 동정하였으며, chlorogenic acid, rutin, isoquercitrin을 꾸지뽕나무 잎 추출물의 지표물질로 선정하였다. HPLC 분석법에 대한 특이성, 정확성, 정밀도 및 정량한계 등을 검증하였다. chlorogenic acid, rutin, isoquercitrin 분석을 위해 표준화된 HPLC 분석법은 0.99% 이상의 상관계수(R2)로 높은 선형성을 가지는 것을 보여주었다. Chlorogenic acid의 전체 회수율은 101.63%였고, 회수율 구간은 101.04-102.68%이었고, rutin의 전체 회수율은 101.81%였고, 전체 회수율 구간은 100.28-102.76%이었고, isoquercitrin의 전체 회수율은 102.185였고, 회수율 구간은 100.30-104.43%였다. 검출한계(LOD)는 chlorogenic acid 0.286㎍/ml, rutin 0.411㎍/ml, isoquercitrin 0.201㎍/ml이었다. 일간정밀도는 chlorogenic acid의 상대표준편차(RSD%)는 0.236%이었으며, rutin의 상대표준편차(RSD%)는 0.559%이었으며, isoquercitrin의 상대표준편차(RSD%)는 0.256%이었다. 이는 식품의약품안전처 건강기능식품 지표물질 확인 가이드라인의 반복성 시험에 따른 지표물질 0.1-1%의 일간정밀도(재현성) 기준인 6% 이내에 속하였다. 이러한 결과는 본 연구에서 개발한 시험법이 일간정말도(재현성)을 평가하는 기준에 부합한다는 것을 알 수 있다. HPLC 분석법으로 확인한 모든 매개변수는 기능성 원료 인정을 위한 제출자료 작성기준을 충족하였다. 따라서 본 연구에서 확립한 HPLC 분석은 꾸지뽕나무 잎 추출물 유래 건강 관련 기능성 제품 또는 의약품 개발 등에 사용할 수 있을 것이다.
In the study, we attempted to establish a High-performance liquid chromatography(HPLC) analysis method with diode array detector(DAD) for standard quantification of chlorogenic acid, rutin, isoquercitrin which are health functional food ingredient in leaves of Cudrania tricuspidata. The major compounds of C. tricuspidata leaves were identified by MS/MS analysis, comparison retention time, and UV absorbance. HPLC method was validated by specificity, accuracy, precision and limit of quantification. The HPLC method showed that calibration curves for each of the three compounds have high linearity with a correlation coefficient (r2) of > 0.99%. The total recovery rate of chlorogenic acid was 101.63%, the recovery section was 101.04-102.68%, the total recovery rate of rutin was 101.81%, the total recovery section was 100.28-102.76%, the total recovery rate of isoquercitrin was 102.185, and the recovery section was 100.30–104.43%. The limits of detection(LOD) for chlorogenic acid 0.286㎍/ml, rutin 0.411㎍/ml, isoquercitrin 0.201㎍/ml, respectively. Daily precision of chlorogenic acid was 0.236%(RSD%), rutin was 0.559%(RSD%), and isoquercitrin was 0.256%(RSD%). This was within 6% of the daily precision (reproducibility) standard of 0.1-1% of the indicator material according to the repeatability test of the Ministry of Food and Drug Safety Health Functional Food Indicator Substance Identification Guidelines. All tested parameters met the appropriate ranges designated in the guideline. Therefore, the HPLC analysis established in this study can be used for the development of health-related functional products or medicines derived from C. tricuspidata leaves extract.
List of tableⅰList of figuresⅱ국문초록 ⅲ영문초록 ⅴⅠ. 서론 1Ⅱ. 재료 및 방법 31. 시약 및 분석장비 32. 꾸지뽕나무 잎 추출물 조제 33. 에탄올의 농도에 따른 꾸지뽕나무 잎 추출물의 함량변화 44. 표준용액 조제 45. HPLC 분석조건 46. 특이성 평가 57. 정확도 평가 68. 일내정밀도(반복성) 평가 69. 일간정밀도(재현성)평가 710. 검출한계(LOD) 측정 711. 직선성 평가 7Ⅲ. 결과 및 고찰 81. 꾸지뽕나무 잎 추출물 분석 및 동정 82. 꾸지뽕나무 잎 추출물의 질량값 분석 103. 꾸지뽕나무 잎의 에탄올 농도에 따른 HPLC profile 비교 및 지표 물질 선정 124. 특이성 평가 155. 정확도 평가 176. 일내정밀도(반복성)평가 197. 일간정밀도(재현성)평가 218. 검출한계 측정 및 직선성 평가 23참고문헌 25감사의 글 29