miR-20b-5p 조절을 통한 인간 대장암세포주에서 1,2,3,4,6-penta-O-galloyl-β-D-glucose의 항암효과 :Anti-cancer Effect of 1,2,3,4,6-penta-O-galloyl-β-D-glucose in Human Colon Cancer Cell Line through miR-20b-5p Regulation

김예린

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자료유형: 학위논문

저자정보: 김예린 (대구대학교, 대구대학교 대학원)

지도교수: 김윤희

발행연도: 2023

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이용수5

이 논문의 연구 히스토리 (2)

2023

miR-20b-5p 조절을 통한 인간 대장암세포주에서 1,2,3,4,6-penta-O-galloyl-β-D-glucose의 항암효과

김예린 식품영양학과 2023.01 학위논문

2022

인간 대장암 세포주에서 miR-20b-5p 조절을 통한 1,2,3,4,6-penta-O-Galloyl-β-D-glucose의 세포사멸 효과

김예린 , 김윤희 한국식품영양과학회 학술대회발표집 2022.10 학술대회자료

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1,2,3,4,6-penta-O-galloyl-β-D-glucose (PGG)는 석류 및 오배자에 함유된 폴리페놀 화합물로 항염, 항균, 항암 등 다양한 생리활성 효과를 가지고 있다. Kwak(2019) 등의 연구에 따르면 PGG는 인간 대장암세포주에서 세포 증식을 억제하고 세포사멸을 유도하는 것으로 보고되었다. 하지만 PGG가 어떤 표적 분자를 조절하여 세포 증식 및 세포사멸을 조절하는지에 대한 기전은 보고되지 않아 표적 분자로서 다양한 유전자의 mRNA 3ʹ UTR에 결합하여 mRNA를 분해하거나 단백질로의 번역 과정을 억제하여 유전자의 발현을 조절하는 것으로 알려진 miRNA를 선택하여 연구를 진행하였다. Small RNA sequencing 기법을 이용하여 PGG가 인간 miRNA 2588개의 발현에 미치는 영향을 평가한 결과, 35개의 miRNA의 발현이 조절되었으며, 35개 miRNA 중 세포 주기 및 세포사멸에 관여하는 것을 분류한 결과 다양한 암에서 종양 유도인자로서 기능하는 miR-20b-5p의 발현이 PGG 처리에 의해 억제되었다. 표적 예측 프로그램인 TargetScan 및 miRDB를 이용하여 표적 유전자 검색을 진행한 결과, bcl-2 like protein 11 (BCL2L11)가 miR-20b-5p와 결합 부위를 갖는 표적 유전자임을 확인하였다. 표적으로 예측된 BCL2L11이 miR-20b-5p와 직접적으로 결합하여 조절받는지 검증하고자 luciferase assay를 측정한 결과, wild type군에서는 miR-20b-5p mimic과의 결합에 의해 유전자 활성이 감소하지만, mutant type군에서는 mimic을 처리하더라도 상대적으로 유전자 활성이 증가하였다. PGG가 표적 유전자인 BCL2L11의 발현에 미치는 영향을 평가한 결과, BCL2L11의 mRNA 및 단백질 발현량이 모두 증가하였다. miR-20b-5p이 BCL2L11 및 세포사멸 관련 유전자의 발현에 미치는 영향을 평가하기 위하여 miR-20b-5p mimic 또는 억제제를 처리하여 측정한 결과 mimic 처리에 의해 BCL2L11의 발현이 감소하며, cleaved caspase 3의 발현이 감소되었다. 반면, 억제제 처리에 의해 BCL2L11의 발현이 증가하였으며, cleaved poly ADP-ribose polymerase (PARP)의 발현이 증가되었다. miR-20b-5p가 세포사멸에 또한 영향을 미치는지 평가한 결과 mimic 처리 시 세포사멸에 변화가 없었으나 억제제 처리에 의해 세포사멸이 유도되었다. PGG가 실제로 miR-20b-5p를 통해서 세포사멸에 관여하는지 평가하고자 PGG와 miR-20b-5p mimic 또는 억제제를 병용 처리하여 실험을 진행하였다. 그 결과 mimic 처리에 의해 BCL2L11의 발현이 감소되지만 PGG와 병용 처리 시 일부 회복되는 경향성을 나타냈으며. cleaved PARP의 발현 또한 동일한 경향성을 보였다. 반대로 억제제와 PGG를 병용 처리한 결과, PGG 처리에 의해 증가 된 BCL2L11의 발현이 억제제와 함께 처리 시 더욱 증가되었으며 세포사멸 또한 더욱 유도하였다.
이상의 결과로부터 PGG는 miR-20b-5p의 억제제처럼 기능하여 miR-20b-5p의 발현을 감소시키고 BCL2L11 mRNA 3ʹ UTR과의 결합을 막아 BCL2L11의 발현 증가시킴으로써 세포사멸을 유도함을 확인하였다.

1,2,3,4,6-penta-O-galloyl-β-D-glucose (PGG) is a polyphenolic compound contained in Punica granatum and Galla Rhois. PGG has various physiological activities such as anti-inflammatory, anti-bacterial and anti-cancer effects. As a result of previous studies, PGG inhibited cell proliferation and induced apoptosis in human colon cancer cell lines.
However, the mechanism by which PGG regulates cell proliferation and apoptosis has not been reported. Therefore, the study was conducted by selecting miRNA that binds to mRNA 3'' UTR of the target gene to decompose mRNA or suppress the protein translation process.
The effect of PGG on 2588 expressions of human miRNA was evaluated using a small RNA sequencing technique. The expression of 35 miRNAs was controlled by PGG treatment. 35 miRNAs were classified as being involved in the cell cycle and apoptosis. Among them, the expression of miR-20b-5p, which functions as a tumor-inducing factor in various cancers, was suppressed by PGG treatment. Through a target gene search using target prediction programs TargetScan and miRDB, it was confirmed that BCL2L11 is a target gene with a binding site with miR-20b-5p. A luciferase assay was measured to verify that BCL2L11, predicted as a target, is regulated by direct binding to miR-20b-5p. As a result, the gene activity decreases due to binding to miR-20b-5p mimic in the wild type group, but the gene activity increases relatively even when treating mimic in the mutant type group.
The effect of PGG on the expression of the target gene BCL2L11 was evaluated. Both the mRNA and protein expression levels of BCL2L11 were increased by PGG treatment. The effect of miR-20b-5p on the expression of BCL2L11 and apoptosis-related genes was measured. The expression of BCL2L11 was reduced by mimic treatment, and the expression of cleaved caspase 3 was reduced. On the other hand, the expression of BCL2L11 was increased by the inhibitor treatment, and the expression of cleaved PARP was increased. Whether miR-20b-5p affects apoptosis was measured. There was no change in apoptosis during mimic treatment, but inhibitor treatment induced apoptosis.
To evaluate whether PGG is involved in apoptosis through miR-20b-5p, an experiment was conducted by treating PGG with a miR-20b-5p mimic or inhibitor in combination. As a result, the expression of BCL2L11 was reduced by mimic treatment, but there was a tendency to partially recover when treated in combination with PGG. The expression of cleaved PARP also showed the same tendency. Conversely, as a result of the combined treatment with inhibitor and PGG, the expression of BCL2L11, which was increased by PGG treatment, was further increased and apoptosis was also induced.
From the above results, it is thought that PGG induces apoptosis by acting like a miR-20b-5p inhibitor, reducing the expression of miR-20b-5p, blocking binding to BCL2L11 mRNA 3'' UTR, and increasing BCL2L11 expression.

#miR-20b-5p #대장암세포주 #1,2,3,4 #6-penta-O-galloyl-β-D-glucose

Ⅰ. 서론 1
Ⅱ. 이론적 배경 3
1. 1,2,3,4,6-penta-O-galloyl-β-D-glucose (PGG) 3
2. 대장암 연구 동향 5
3. miRNA 6
1) miRNA 생합성 및 기능 6
2) miRNA와 암 8
4. BCL2L11 10
5. 세포자멸사 12
Ⅲ. 연구방법 및 내용 15
1. 실험 재료 15
2. 세포 배양 17
3. 세포 증식 평가 18
4. Small RNA sequencing 분석 19
5. Target gene 검색 20
6. Dual luciferase 활성 평가 21
7. miRNA mimic 및 inhibitor를 이용한 형질 전환 22
8. mRNA 수준에서의 발현량 평가 23
9. 단백질 발현 평가 25
10. 세포자멸사 평가 27
11. 통계 분석 28
Ⅳ. 결과 및 고찰 29
1. PGG가 인간 대장암세포주인 HCT-116 세포 생존율 및 세포자멸사에 미치는 영향 29
2. PGG가 세포자멸사 관련 유전자 발현에 미치는 영향 32
3. PGG가 miRNA 발현에 미치는 영향 34
4. miR-20b-5p의 직접적 표적 유전자 예측 36
5. PGG 및 miR-20b-5p가 BCL2L11 발현에 미치는 영향 38
6. miR-20b-5p가 세포자멸사 관련 기전에 미치는 영향 40
7. miR-20b-5p가 세포자멸사에 미치는 영향 42
8. miR-20b-5p 및 PGG 병용 처리가 BCL2L11 및 세포사멸 관련 유전자 발현에 미치는 영향 44
9. miR-20b-5p 및 PGG 병용 처리가 세포자멸사에 미치는 영향 48
Ⅴ. 결론 및 제언 50
참고문헌 53
영문초록 64

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