Archangium gephyra KYC5002의 포자 형성과 tubulysin 생산의 정량적 분석 :Quantitative analysis of spore formation and tubulysin production by Archangium gephyra KYC5002

김지하

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자료유형: 학위논문

저자정보: 김지하 (호서대학교, 호서대학교 대학원)

지도교수: 조경연

발행연도: 2023

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이용수4

이 논문의 연구 히스토리 (2)

2023

Archangium gephyra KYC5002의 포자 형성과 tubulysin 생산의 정량적 분석

김지하 2023.01 학위논문

2022

분산변이주 Archangium gephyra KYC5002의 자실체 발달과 포자 형성에 대한 정량적 분석

김지하 , 유의상 , 박서희 외 1명 미생물학회지 2022.12 학술저널

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점액세균 Archangium gephyra KYC5002는 A. gephyra KYC2615의 분산변이주로 이차대사 생리활성물질인 argyrin과 tubulysin을 생산한다. 본 연구에서는 KYC5002 균주를 대상으로 A. gephyra의 자실체와 글리세롤 포자 형성을 위한 정량적 조건을 조사하였고 생성된 포자의 형태와 열 저항성을 조사하였다. 그리고, KYC5002 균주에서 유래된 KYC5006 균주를 대상으로 플라스크와 발효조에서의 tubulysin 생산 최적화를 진행하였으며, 생산된 tubulysin A의 분리, 정제과정을 확립하였다.
액체배지에서 분산 성장하는 A. gephyra KYC5002 균주는 WCE 한천평판배지에서 모균주 KYC2615에 비해 상대적으로 크기는 작지만 형태적으로는 유사한 자실체를 형성하므로 정량적 자실체 형성 분석에 적합한 균주로 판단되었다. KYC5002 균주는 10 mM 3-morpholinopropane-1-sulfonic acid, 8 mM MgSO4, 0.015% casitone, 3% 한천을 함유한 MMC 배지에서 가장 온전한 자실체를 형성하였는데, 세포 현탁액을 20 μl 반점으로 MMC 배지 위에 올려놓은 경우, 5×108-5×109 cells/ml 농도에서만 자실체를 형성하고 세포 농도가 이보다 낮거나 높으면 자실체를 형성하지 못하였다. 가늘고 긴 영양세포들은 자실체 내에서 굵고 짧은 자실체 포자로 변형되었다. 0.5 M 글리세롤 첨가에 의해 유도되는 글리세롤 포자로의 변형은 액체배양 시 모든 시점에서 가능하였지만 세포들이 왕성히 성장하는 시기에는 높은 효율로 이루어졌고, 정지기에 들어간 노쇠한 세포들의 경우에는 낮은 효율로 이루어졌다. 생성된 글리세롤 포자는 형태적으로 자실체 포자와 유사하였으며, 초음파와 열에 저항성을 보였다. 하지만 열 저항성이 자실체 포자에 비해 낮았다.
A. gephyra KYC5006 균주는 KYC5002 균주에서 argyrin 생합성 유전자 arg2를 불활성시켜 tubulysin만 생산하도록 제조된 균주이다. KYC5002 균주의 tubulysin A 생산수율이 기존에 tubulysin 생산에 사용하던 A. gephyra KYC5004 균주에 비해 약 8배 더 우수하였다. 따라서 본 연구에서는 KYC5006에 의한 tubulysin 생산 최적화를 위하여 tubulysin 생산에 사용하는 CYS 배지를 구성하는 각 성분들의 영향을 분석하였고, 이를 기반으로 CYS 배지를 변형시킨 CYS1 배지를 디자인하였다. KYC5006 균주는 50 ml의 배지가 들어있는 250 ml 플라스크에서 배양하는 경우, 기존에 사용하였던 CYS 배지에서는 2.4 mg/l의 tubulysin A를 생산하였는데, CYS1 배지에서는 3.0 mg/l의 tubulysin A를 생산하여 약 25%의 생산수율 증가를 보였다. 발효조를 사용하여 3리터 CYS1 배지에서 배양한 경우에는 최대 2.5 mg/l의 tubulysin A를 생산하였다. 본 연구에서는 또한 배양 후 회수한 흡착 레진으로부터 tubulysin A를 추출하여 분리하는 조건을 분석함으로써 tubulysin A의 분리·정제를 위한 방법을 확립하였다.

The myxobacterium Archangium gephyra KYC5002, a dispersion mutant of A. gephyra KYC2615, produces argyrins and tubulysins, which are bioactive secondary metabolites. In this study, I quantitatively analyzed fruiting body development and glycerol spore formation in A. gephyra using the KYC5002 strain and investigated the morphology and heat resistance of the generated spores. In addition, I optimized culture conditions for tubulysin production in flasks and fermenters, and established processes for separation and purification of the produced tubulysin A.
A. gephyra KYC5002 grown in a dispersed manner in liquid media was considered suitable for quantitative analysis of fruiting body formation because it formed fruiting bodies smaller in size but morphologically similar to those of the parent strain KYC2615 on WCE agar plates. The KYC5002 strain developed the most intact fruiting bodies on MMC agar plates containing 10 mM 3-morpholinopropane-1-sulfonic acid, 8 mM MgSO4, 0.015% casitone, and 3% agar. When KYC5002 cells were placed on an MMC agar plate in 20 µl spots, fruiting bodies developed when the cell suspension concentration was 5×108–5×109 cells/ml. No fruiting bodies were formed at cell suspension concentrations higher or lower than that. Long, thin vegetative cells transformed into thick, short fruiting body spores within fruiting bodies. Induction of glycerol spore transformation by addition of 0.5 M glycerol was possible at all time points in liquid culture, but was achieved with high efficiency during the period of vigorous cell growth, and with low efficiency during the stationary phase. Glycerol induced spores were morphologically similar to fruiting body spores, and showed resistance to ultrasound and heat; however, their heat resistance was lower than that of fruiting body spores.
A. gephyra KYC5006, a derivative of KYC5002, produces only tubulysin, since its argyrin biosynthetic gene arg2 is inactivated by plasmid insertion. The production yield of tubulysin A from the KYC5002 strain was about 8 times higher than that of A. gephyra KYC5004 previously used for tubulysin production. Therefore, in this study, I analyzed the effect of each component of CYS medium on tubulysin yield, to optimize tubulysin production by KYC5006 and designed CYS1 medium (modified from CYS medium) based on the results. When the KYC5006 strain was cultured in a 250 ml flask containing 50 ml of medium, 2.4 mg/l tubulysin A was produced in CYS medium, and 3.0 mg/l tubulysin A was produced in CYS1 medium (a 25% increase in production yield). When cultured in 3 liters of CYS1 medium in a fermenter, up to 2.5 mg/l of tubulysin A was produced. I also established a method for separation and purification of tubulysin A by analyzing the conditions for extracting and separating tubulysin A from the adsorption resin recovered from the culture broth.

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