Anti-obesity Activity of Ecklonia stolonifera Extract in 3T3-L1 adipocytes and obese mice :3T3-L1 지방세포와 비만 마우스에서 곰피 추출물의 항비만 활성

Xionggao Han

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자료유형: 학위논문

저자정보: Xionggao Han (강원대학교, 강원대학교 대학원)

지도교수: 이옥환

발행연도: 2023

저작권: 강원대학교 논문은 저작권에 의해 보호받습니다.

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2023

Anti-obesity Activity of Ecklonia stolonifera Extract in 3T3-L1 adipocytes and obese mice

Xionggao Han 식품환경융합학과 2023.01 학위논문

2021

Anti-obesity Activity of Standardized Ecklonia stolonifera Extract in 3T3-L1 Adipocytes

Xionggao Han , Sun Il Choi , Xiao Men 외 8명 한국식품영양과학회 학술대회발표집 2021.10 학술대회자료

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비만은 유전적, 식습관, 생활습관, 환경적인 요인 등의 상호작용에 의해 복합적으로 발생하는 질병입니다. 만성적인 양성 에너지 균형과 체지방량 증가를 선호하며, 발생률이 빠르게 증가하고 있습니다. 이는 중요한 공중보건 문제로 인식되며, 대사 장애 및 만성질환 발생을 촉진합니다. 최근 연구에 따르면 천연 제품이 비만 예방에 효과적일 수 있으며, 다중 천연 제품 조합은 시너지 활동을 유발하여 분자 표적에 대한 생체 이용률과 작용을 증가시킵니다. 본 논문에서는 갈조류인 곰피의 항비만 잠재력과 작용 메커니즘에 대해 논의합니다. 곰피는 다중 생물활성물질을 함유하고 있으며, 항산화, 항염증, 항비만 등의 생물학적 활성을 가지고 있습니다. 특히, 최근 연구에서는 곰피 추출물이 체중감량과 체지방량 감소를 유발하는 것으로 나타났습니다. 이를 통해 곰피가 비만 예방에 효과적일 수 있으며, 이에 대한 작용 메커니즘 분석이 필요합니다. 따라서, 본 논문은 곰피의 항비만 잠재력 및 작용 메커니즘을 분석하여, 비만 예방에 대한 신뢰성 높은 천연 제품으로서의 활용 가능성을 제시합니다.
첫번째로 본 연구에서 곰피추출물을 이용하여 건강기능식품 개발 시 원료의 표준화를 위하여 HPLC-PDA를 이용하여 지표성분 dieckol의 분석법 개선 및 검증을 실시하였다. 그리고 다양한 in vitro 모델을 사용하여 곰피 추출물의 라디칼 소거 활성을 조사합니다. 분석법의 유효성 검증은 ICH가이드라인에 근거하여 특이성, 직선성, 정확성, 정밀성, 검출한계 및 정량한계를 통해 신뢰성 및 타당성을 검증하였습니다. 또한 ESE의 총 페놀, 총 플라보노이드 및 dieckol 함량은 각각 9.64±0.04 mg GAE/g, 2.72±0.08 mg RE/g 및 27.39±0.50 mg/g이었다. ESE의 항산화 활성은 용량 의존적으로 증가하는 것으로 나타났습니다. 이러한 결과는 곰피 추출물이 건강기능식품 개발을 위한 전임상 생물자원으로 활용될 수 있으며 우수한 항산화 활성을 가지고 있음으로 사료됩니다.
다음으로 지방세포에서 ROS 생산과 지질 축적을 막는 메커니즘을 제어하는 것이 매우 중요합니다. 이에 대한 연구에서는 3T3-L1 지방 세포와 고지 방식을 먹인 비만 ICR 마우스에서 산화 스트레스로 인한 지질 축적을 억제하는 ESE의 능력을 평가했습니다. 그 결과, 고지 방식을 먹인 ESE 처리된 비만 ICR 마우스는 개선된 혈장 지질 과 함께 감소된 체중 및 지방 조직 무게를 보였습니다. in vitro 및 in vivo 연구에서 ESE는 지방 생성 관련 유전자의 발현을 억제하고 지방 분해 관련 유전자의 발현을 증가시키는 것으로 나타났습니다. 이러한 작용은 AMP단백질 활성을 통해 이루어진 것으로 밝혀졌습니다. 또한 ESE는 ROS 생성에 관여하는 효소의 발현을 감소시키고 항산화 효소의 발현을 증가시켜 ROS 수준을 감소시켰습니다. 이러한 결과는 ESE가 강력한 항산화 특성을 가지고 있으며, 지방세포 생성 동안 ROS 생성을 감소시켜 산화 스트레스로 인한 지질 축적을 억제한다는 것을 시사합니다.
마지막으로 해당 연구에서는 곰피 추출물을 함유한 인체적용시험식품(ESETM)을 제조하여 곰치추출물의 항비만 효능을 기반으로 한 건강기능식품으로의 잠재성이 검증되었습니다. ESETM의 효능 검증을 위해 3T3-L1 지방세포와 고지방식을 섭취한 비만 마우스를 대상으로 비임상 효과를 확인하였으며, in vitro 및 in vivo 실험에서의 결과를 통해 ESETM이 지방 생성, 지방 축적 및 ROS 생성을 억제하여 체중 증가를 억제한다는 것을 보여주었습니다. 이러한 결과는 ESETM이 건강기능식품으로의 잠재성을 가진다는 것을 시사하며, 더욱 광범위한 임상 연구가 필요하다는 점을 알리고 있습니다.

Obesity is a complex disease caused by the interaction of various genetic, dietary, lifestyle, and environmental factors, which favors a chronic positive energy balance and increases body fat mass. The incidence of obesity is rising at an alarming rate and is becoming a significant public health concern with incalculable social costs. Indeed, obesity facilitates the development of metabolic disorders such as diabetes, hypertension, cardiovascular diseases, and chronic conditions such as stroke, osteoarthritis, sleep apnea, cancer, and inflammation-based pathologies. Recent research demonstrated the potential of natural products to counteract obesity. Multiple-natural product combinations may result in a synergistic activity that increases their bioavailability and action on multiple molecular targets, offering advantages over chemical treatments. In this paper, we discuss the anti-obesity potential of Ecklonia stolonifera (one of the blown algae) and analyze their mechanisms.
Firstly, this study investigated the validation of the modified analytical method for determination of dieckol content in Ecklonia stolonifera extract (ESE). And this study investigates the radical scavenging activities of ESE using various in vitro models. Previously reported analytical method modified and validated by the guideline of International Conference on Harmonization (ICH). For the method validation the specificity, linearity, precision, accuracy, limit of detection (LOD), and limit of quantification (LOQ) of dieckol were measured using HPLC-PDA. And proved the analytical method was validated for the detection of dieckol in ESE. Also, the total phenol, total flavonoid and dieckol contents of ESE were 9.64±0.04 mg GAE/g, 2.72±0.08 mg RE/g and 27.39±0.50 mg/g, respectively. The antioxidant activity of ESE was exhibited to increase in a dose-dependent manner. These results suggested that ESE possesses antioxidant activities which can be used as preclinical bioresources for development of health functional foods.
Controlling the mechanisms that stop ROS production and lipid buildup in adipocytes is essential. We evaluate the ability of ESE to inhibit lipid accumulation caused by oxidative stress in 3T3-L1 adipocytes and high-fat diet-fed obese ICR mice. We report that ESE-treated obese ICR mice, which were fed a high-fat diet, showed reduced whole-body and adipose tissue weights with improved plasma lipid profiles. In vitro and in vivo studies have indicated that ESE inhibited the expression of adipogenesis-related genes associated with fat accumulation through AMP-activated protein kinase activity and increased the expression of lipolysis-related genes. Additionally, ESE reduced the expression of enzymes involved in reactive oxygen species (ROS) production and increased the expression of antioxidant enzymes, thereby reducing ROS levels. These findings suggest that ESE possesses strong antioxidant properties and inhibits oxidative stress-induced lipid accumulation by reducing ROS production during adipocyte generation.
Lastly, we prepared a clinical trial test material (ESETM, test material of Ecklonia stolonifera extract) to develop a health functional food based on its anti-obesity effect. The anti-obesity effect of ESETM was evaluated in 3T3-L1 adipocytes and obese mice fed a high-fat diet (HFD) to confirm its preclinical trial effect before application in clinical trial. Adipogenesis is a process of adipocyte differentiation that causes an increase in lipid accumulation and reactive oxygen species (ROS) production. In vitro study results indicated that ESETM significantly inhibited lipid accumulation and ROS production during adipogenesis and lipogenesis. In vivo, ESETM-treated ICR mice had reduced HFD-induced body weight gain, food efficiency ratio, adipose tissue weight, and liver weight and showed improved serum lipid profiles. Our results show that ESETM inhibits weight gain by regulating the expression of proteins involved in adipogenesis, lipogenesis, lipolysis, and thermogenesis.
In conclusion, this study demonstrates the potential of ESE, in counteracting obesity and its associated metabolic disorders and chronic conditions. The study findings suggest that ESE possesses strong antioxidant properties and inhibits oxidative stress-induced lipid accumulation by reducing ROS production during adipocyte generation. In our research, also prepared a clinical trial test material (ESETM, test material of Ecklonia stolonifera extract) to develop a health functional food based on its anti-obesity effect. These findings offer promising avenues for the development of natural-based therapies to tackle obesity and improve public health outcomes.

#Ecklonia stolonifera #dieckol #method validation #anti-obesity #reactive oxygen species

ABSTRACT i
CONTENTS iv
LIST OF TABLES viii
LIST OF FIGURES ix
ABBREVIATIONS xiv
I. General Introduction 1
II. Literature Review 5
2.1. Ecklonia stolonifera 6
2.2. Extraction Methods of Ecklonia stolonifera 9
2.2.1. Methanol Extract 11
2.2.2. Ethanol Extract 11
2.3. Bioactive Compounds of Ecklonia stolonifera 12
2.3.1. Fucosterol 12
2.3.2. Eckol 12
2.3.3. Dieckol 12
2.3.4. Phlorofucofuroeckol A 13
2.3.5. Other Components 13
2.4. Bioactivities of Ecklonia stolonifera 17
2.4.1. Antibacterial Activity 17
2.4.2. Tyrosinase Inhibition 18
2.4.3. Antioxidant Activity 18
2.4.4. Anti-Obesity Activity 20
2.4.5. Anti-Diabetic Activity 20
2.4.6. Anti-Inflammatory Activity 21
2.4.7. Treat Neurological Disorders 22
2.4.8. Other Functionalities 22
2.5. Obesity 28
2.6. The Role of Oxidative Stress in Adipose Tissue Function 30
2.6.1. Sources of ROS in Adipose Tissue 30
2.6.2. Effect of ROS in Adipose Tissue 31
2.6.3. Antioxidant Systems in Adipose Tissue 31
III. Analysis of the Bioactive Components and Antioxidant Activities of Ecklonia stolonifera Extract 33
3.1. Abstract 34
3.2. Introduction 35
3.3. Materials and Methods 37
3.3.1. Materials and Reagents 37
3.3.2. Total Phenolic and Flavonoid Contents 37
3.3.3. DPPH Radical Scavenging Activity 37
3.3.4. ABTS Radical Scavenging Activity 38
3.3.5. Ferric Reduction Antioxidative Power (FRAP) Assay 38
3.3.6. Reducing Power Assay 38
3.3.7. Quantitation of Dieckol in the ESE by HPLC-PDA 38
3.3.8. Method Validation 39
3.3.9. Statistical Analysis 40
3.4. Results and Discussion 41
3.4.1 Bioactive Compounds and Antioxidant Activity of ESE 41
3.4.2 Method Validation for Determination of Dieckol 47
3.4.3 Analysis of Dieckol Contents 51
IV. Radical Scavenging-Linked Anti-obesity Effect of Standardized Ecklonia stolonifera Extract on 3T3-L1 Preadipocytes and High-Fat Diet-Fed ICR Mice 53
4.1. Abstract 54
4.2. Introduction 55
4.3. Materials and Methods 58
4.3.1. Materials and Reagents 58
4.3.2. Animal Experiments 58
4.3.3. Biochemical Analysis 59
4.3.4. Cell Culture 59
4.3.5. Cell Viability 59
4.3.6. ORO Staining and NBT Assay 60
4.3.7. Western Blot Analysis 60
4.3.8. Statistical Analysis 61
4.4. Results 62
4.4.1. ESE Prevents Development of Obesity in HFD-Fed Obese Mice. 62
4.4.2. ESE Inhibits Lipid Accumulation and ROS Production 69
4.4.3. ESE Reduces ROS-Generating Factor in the WAT of HFD-Induced Obese Mice and 3T3-L1 Cells 73
4.4.4 ESE Reduces ROS-Regulating Antioxidant Enzyme expressions in HFD-fed Obese Mice and 3T3-L1 Cells 78
4.4.5 ESE Stimulates Adipogenesis in HFD-fed Obese Mice and 3T3-L1 Adipocytes 83
4.4.6 ESE Promotes Lipid Metabolism-Related Enzymes in HFD-fed Obese Mice and 3T3-L1 Adipocytes 88
4.5. Discussion 93
V. Anti-obesity Activity of ESETM in 3T3-L1 Preadipocytes and High-Fat Diet-Fed ICR Mice 95
5.1. Abstract 96
5.2. Introduction 97
5.3. Materials and Methods 99
5.3.1 Materials and Reagents 99
5.3.2 Animal Experiments 99
5.3.3 Biochemical Analysis 100
5.3.4 Histological Analysis 100
5.3.5 Cell Culture 100
5.3.6 Cell Viability 101
5.3.7 ORO Staining and NBT Assay 101
5.3.8 Western Blot Analysis 102
5.3.9 Statistical Analysis 102
5.4. Results 103
5.4.1 ESETM Prevents Development of Obesity in HFD-Fed Obese Mice. 103
5.4.2. ESETM Inhibits Lipid Accumulation and ROS Production 110
5.4.3 ESETM Reduces Adipogenesis in the WAT of HFD-Induced Obese Mice and 3T3-L1 Cells 115
5.4.4 ESETM Reduces Lipogenesis in HFD-Fed Obese Mice and Adipocytes 120
5.4.5 ESETM Stimulates Lipolysis in HFD-Fed Obese Mice and Adipocytes 125
5.4.6 ESETM Promotes Thermogenesis Browning in HFD-Fed Obese Mice and Adipocytes 132
5.5. Discussion 137
VI Conclusion 139
References 143
Abstract (Korean) 154

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