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논문 기본 정보

자료유형
학술저널
저자정보
저널정보
한국미생물생명공학회 Journal of Microbiology and Biotechnology Journal of Microbiology and Biotechnology 제27권 제2호
발행연도
2017.1
수록면
335 - 341 (7page)

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The complexity of the bacterial recombination system is a barrier for the construction of bacterial mutants for the further functional investigation of specific genes. Several protocols have been developed to inactivate genes from the genus Pseudomonas. Those protocols are complicated and time-consuming and mostly do not enable easy construction of multiple knock-ins/outs. The current study describes a single and double crossover-recombination system using an optimized vector-free allele-exchange protocol for gene disruption and gene replacement in a single species of the family Pseudomonadaceae. The protocol is based on selfligation (circularization) for the DNA cassette which has been obtained by overlapping polymerase chain reaction (Fusion-PCR), and carries an antibiotic resistance cassette flanked by homologous internal regions of the target locus. To establish the reproducibility of the approach, three different chromosomal genes (ncRNA31, rpoN, rpoS) were knocked-out from the root-associative bacterium Pseudomonas stutzeri A1501. The results showed that the P. stutzeri A1501 mutants, which are free of any plasmid backbone, could be obtained via a single or double crossover recombination. In order to optimize this protocol, three key factors that were found to have great effect on the efficiency of the homologous recombination were further investigated. Moreover, the modified protocol does not require further cloning steps, and it enables the construction of multiple gene knock-in/out mutants sequentially. This work provides a simple and rapid mutagenesis strategy for genome editing in P. stutzeri, which may also be applicable for other gram-negative bacteria.
#Vector-free allele exchange #VFAE) #homologous recombination #Pseudomonas stutzeri #mutagensis #genome editing

목차

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Aagot N / 2001 / An altered Pseudomonas diversity is recovered from soil by using nutrient-poor Pseudomonas-selective soil extract media / Appl. Environ. Microbiol 67 : 5233 google schola Aranda J / 2010 / A rapid and simple method for constructing stable mutants of Acinetobacter baumannii / BMC Microbiol 10 : 279 ~ google schola Boyle NR / 2013 / Recombineering to homogeneity: extension of multiplex recombineering to large-scale genome editing / Biotechnol google schola Christie-Oleza JA / 2008 / ISPst9, an ISL3-like insertion sequence from Pseudomonas stutzeri AN10 involved in catabolic gene inactivation / Int. Microbiol 11 : 101 ~ 110 google schola Clark ST / 2015 / Phenotypic diversity within a Pseudomonas aeruginosa population infecting an adult with cystic fibrosis / Sci. Rep 5 : 10932 ~ google schola

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