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논문 기본 정보

자료유형
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저널정보
한국미생물생명공학회 Journal of Microbiology and Biotechnology Journal of Microbiology and Biotechnology 제25권 제1호
발행연도
2015.1
수록면
89 - 97 (9page)

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Bacillus subtilis HK176 with high fibrinolytic activity was isolated from cheonggukjang, a Korean fermented soyfood. A gene, aprE176, encoding the major fibrinolytic enzyme was cloned from B. subtilis HK176 and overexpressed in E. coli BL21(DE3) using plasmid pET26b(+). The specific activity of purified AprE176 was 216.8 ± 5.4 plasmin unit/mg protein and the optimum pH and temperature were pH 8.0 and 40°C, respectively. Error-prone PCR was performed for aprE176, and the PCR products were introduced into E. coli BL21(DE3) after ligation with pET26b(+). Mutants showing enhanced fibrinolytic activities were screened first using skim-milk plates and then fibrin plates. Among the mutants, M179 showed the highest activity on a fibrin plate and it had one amino acid substitution (A176T). The specific activity of M179 was 2.2-fold higher than that of the wild-type enzyme, but the catalytic efficiency (kcat/Km) of M179 was not different from the wild-type enzyme owing to reduced substrate affinity. Interestingly, M179 showed increased thermostability. M179 retained 36% of activity after 5 h at 45°C, whereas AprE176 retained only 11%. Molecular modeling analysis suggested that the 176th residue of M179, threonine, was located near the cation-binding site compared with the wild type. This probably caused tight binding of M179 with Ca2+, which increased the thermostability of M179.
#Bacillus subtilis #fibrinolytic enzyme #error-prone PCR #thermostability

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Agrebi R / 2009 / BSF1 fibrinolytic enzyme from a marine bacterium Bacillus subtilis A26: purification, biochemical and molecular characterization / Process Biochem 44 : 1252 google schola Bradford MM / 1976 / A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding / Anal. Biochem 72 : google schola Bryan P / 1992 / Energetics of folding subtilisin BPN / Biochemistry 31 : 4937 ~ 4945 google schola Bryan PN / 2000 / Protein engineering of subtilisin / Biochim. Biophys. Acta 1543 : 203 ~ 222 google schola Cadwell RC / 1994 / Mutagenic PCR / Genome Res 3 : S136 ~ S140 google schola

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