Rabies virus와 Porcine Rotavirus 정량검출을 위한 TaqMan Probe Real-time PCR : TaqMan probe real-time PCR for auantitative detection of rabies virus and porcine rotavirus :

고운영

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자료유형: 학위논문

저자정보: 고운영 (한남대학교, 한남대학교 대학원)

지도교수: 김인섭

발행연도: 2013

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이용수2

이 논문의 연구 히스토리 (2)

2015

소유래 성분 원재료 사용 생물의약품과 의료기기 제조 공정에서 bovine adenovirus type 1 정량 검출을 위한 TaqMan probe real-time PCR

고운영 , 노나경 , 김인섭 미생물학회지 2015.09 학술저널

2013

Rabies virus와 Porcine Rotavirus 정량검출을 위한 TaqMan Probe Real-time PCR : TaqMan probe real-time PCR for auantitative detection of rabies virus and porcine rotavirus

고운영 생명과학과 2013.01 학위논문

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세포주를 사용하여 생산되는 모든 생물학적 의약품은 원료 물질 유래 바이러스의 오염 가능성이 있다 이러한 심각한 오염은 바이러스가 감염된 세포주로부터 유입될 수도 있고 세포 조작 시 바이러스로부터 오염될 수 있다. 바이러스 오염의 중요한 원인은 세포배양 공정에 첨가되는 소유래 혈청(FBS)이나 돼지유래 트립신에 의해 오염될 수 있다. 따라서 바이러스 동물세포에서의 바이러스 검출은, 소 유래 혈청과 돼지 유래 트립신에의 오염될수 있기 때문에 신속한 바이러스 검출 시험법이 최종 제품에서 바이오의약품에 대한 안전성 보증을 위해 필요하다.
본 연구에서는 rabies virus와 PRoV를 신속하게 정량적으로 검출 할 수 있는 TaqMan probe real-time PCR 시험법을 확립하였다. Rabies virus와 PRoV 핵산 증폭을 위한 특이적인 primer를 선별하였으며, TaqMan probe를 이용한 정량 분석법을 최적화 하였다. rabies virus의 모든 야외종과 백신 균주를 검출 할 수 있었다.
Rabies virus의 분석법의 민감도는 3.87 × 100 copies/μL로 계산하였다. 확립된 시험법의 신뢰성 검증결과 이 real-time PCR 방법은 BRbv에 매우 특이성이 높았으며 재현성이 우수하였다.
PRoV의 분석법의 민감도는 3.37 × 101 copies/μL로 계산하였다. 확립된 시험법의 신뢰성 검증결과 이 real-time PCR 방법은 PRoV에 매우 특이성이 높았으며 재현성이 우수하였다. Rabies virus와 PRoV의 TaqMan probe real-time PCR을 이용한 정량 분석법은 세포배양유래 생물의약품 생산공정에서 위해성 바이러스를 검출을 위한 기존의 시험법을 대체할 수 있는 우수한 방법으로 사료된다.

#Rabies-Virus #Porcine-Rotavirus #real-time-PCR

I. 서 론 1
II. 실험재료 및 방법 4
1. Rabies virus 유전자 정량 검출을 위한 Real-ime PCR 최적화 4
1.1 Rabies virus (BRbv) 유전자 단편 합성 4
1.1.1 BRbv 유전자 단편 합성을 위한 primer 디자인 4
1.1.2 PCR을 이용한 BRbv 유전자 단편 합성 7
1.2 Primer와 probe 디자인 7
1.3 Rabies virus 유전자 plasmid standard 제작 및 plasmid DNA 추출 12
1.4 Rabies virus 유전자 정량 최적화 14
1.5 Real-time PCR의 신뢰성 검증 14
1.6 Rabies Virus RNA 단편 standard 제조 및 이를 이용한 민감도 측정 15
1.7 TaqMan probe real-time PCR 이용한 rabies virus 검출 16
1.8 Rabies virus 유전자 copy to RNA standard ratio 결정 18
2. Porcine rotavirus (PRoV)의 정량 검출을 위한 Real-time PCR 최적화 18
2.1 Porcine rotavirus 배양과 정량 18
2.2 Primer와 probe 디자인과 PRoV genomic RNA 추출 18
2.3 PRoV 검출을 위한 Reverse transcription (RT) 21
2.4 PRoV plasmid standard 제작 및 plasmid DNA 추출 21
2.5 PRoV 정량 최적화 23
2.6 Real-time PCR의 신뢰성 검증 24
2.7 PRoV RNA 단편 standard 제조 및 이를 이용한 민감도 측정 25
2.8 PRoV 유전자 copy 수 대 TCID50 ratio 결정 25
III. 결 과 27
1. Rabies virus 유전자 정량 검출을 위한 Real-ime PCR 최적화 27
1.1 PCR을 이용한 BRbv 유전자 합성 27
1.2 Rabies virus 유전자 plasmid standard 제작 29
1.3 Rabies virus 유전자 정량 최적화 31
1.4 Real-time PCR의 신뢰성 검증 36
1.5 Rabies virus 유전자 RNA standard 민감도(sensitivity) 및 검출한계 41
1.6 TaqMan probe real-time PCR 이용한 rabies virus 야생형과 백신균주 검출 44
1.7 Rabies visur 유전자 copy to RNA standard ratio 결정 46
2. Porcine rotavirus (PRoV)의 정량 검출을 위한 Real-time PCR 최적화 48
2.1 PRoV plasmid standard 제작 48
2.2 PRoV의 정량 최적화 50
2.3 Real-time PCR 신뢰성 검증 55
2.4 PRoV 유전자 RNA standard 민감도(sensitivity) 및 검출한계 64
2.5 PRoV 유전자 copy to TCID50 ratio 결정 65
IV. 고 찰 71
V. 참고문헌 73
VI. Abstract 76
VII. 적 요 78

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