최근 들어 소비제품과 의료부분에서 은 나노입자를 활용한 제품의 생산이 증가하고 있다. 하지만 그 독성, 환경거동 및 독성동태에 대한 정보는 충분하지 않다. 따라서 본 연구에서는 은 나노입자의 독성시험 용액에서의 안정성을 먼저 평가한 후 은 나노입자의 노출농도와 독성의 관계를 평가하기 위한 독성동태 연구 및 은 나노입자의 혈액 응고 및 혈소판 응집에 대한 연구를 실시하였다.
독성시험을 실시하기 전 나노입자의 물성을 확인하기 위해 은 나노입자의 독성시험 용제에서의 안정성을 평가하였다. 먼저, 은 나노입자의 정맥주사 제제에 필요한 다양한 등장액에서의 입자 크기, 형태, 제타전위, 이온형성을 측정하였다. 은 나노입자는 PBS 등 이온이 풍부한 용매에서는 응집 및 침전이 일어나는 반면 5% 포도당 용액, 2% 글리세롤 용액에서는 응집되지 않고 안정하였다. 5% 포도당 용액, 2% 글리세롤 용액에서 평균 입도는 6 ~ 10 nm 이었으며 증류수에 희석되었을 때의 크기와 비슷하였다. 제타전위는 -30 ~ -60 mV 이었으며 원액의 제타 전위 범위 안에 있었다. 은 나노입자는 본 시험에서 측정한 시간 동안 안정성이 유지되었으며 10℃ ~ 36℃의 온도, 10 ~ 1000 ppm의 농도에서도 물리적 안정성이 유지되었다. 은 나노입자를 희석한 용액의 삼투압은 299±1 mOsm/kg로 등장액의 범위였으므로 5% 포도당 용액, 2% 글리세롤 용액은 은 나노입자 희석을 위한 정맥주사 용제로 적합하다고 판단되었다. 혈소판응집 및 혈액응고 시험에 사용되는 용제(washed platelet buffer, fetal bovin serum, distilled water)에서의 안정성은 사용 용제에서 입도 분포를 측정함으로써 확인하였다. 그 결과 평균 입도는 20 nm로 유지되어 안정하다고 판단되었다.
은 나노입자의 독성동태 연구를 위하여 은 나노입자 정맥투여 후 28일간 혈중 동태, 은 나노입자와 은 이온의 독성동태 비교, 반복 투여 후 은 나노입자의 모체에서 태자로의 이행 연구를 실시하였다.
정맥으로 은 나노입자를 노출할 때 이를 통하여 혈중 동태, 조직 분포, 배설을 알 수가 있기 때문에 수컷 SPF New Zealand White 토끼에 은 나노입자를 단회 정맥투여(n=4, 투여 용량 : 5, 0.5 mg/kg)한 결과, 정맥투여 후 은 농도가 급격히 상승한 후 점차 감소하였으며 28일까지 90% 정도가 제거된 것을 확인할 수 있었다. AUC(last)는 고용량에서 3.65±0.68 μg·day/mL, 저용량에서 0.90±0.16 μg·day/mL 이었으며 반감기는 고용량에서 11.7±1.3 day, 저용량에서 16.3±2.9 day로 계산되었다.
최근 은 나노입자의 독성 및 효과가 은 나노입자에서 방출되는 은 이온의 영향이라는 것이 알려지면서 은 나노입자와 은 이온의 비교연구결과가 나오고 있다. 은 나노입자와 은 이온을 랫드에 경구 투여한 후(n=5, 투여 용량 : 20, 2 mg/kg) 독성동태를 비교하여 본 결과 AUC는 고용량 은 이온 투여군에서 3.81±0.57 μg·day/mL, 은 나노입자 투여군에서 1.58±0.25 μg·day/mL 이었으며 간, 폐, 신장 조직 중 간에서 은 나노입자 및 은 이온의 축적이 높았다. 따라서 간이 표적 장기로 판단되었다. 소변으로의 배설은 은 이온에서 높았으나 변으로의 배설은 은 나노입자에서 높았다.
은 나노입자가 태반을 통하여 태아에 노출되는지를 확인하기 위하여 은 나노입자를 암컷 및 수컷 랫드에 반복적으로 투여하고 교배한 후 태어난 새끼의 간, 신장, 폐, 뇌 조직 중에서 은 농도를 분석한 결과 모든 장기에서 은이 검출되었으며 특히 신장에서 높은 농도로 축적되었다. 따라서 은이 태반을 통하여 태자에게로 노출될 수 있음을 확인하였다.
랫드에서 전혈, platelet rich plasma (PRP), washed platelet (WP)를 얻어 은 나노입자가 혈액응고 및 혈소판 응집에 미치는 영향에 대해 조사하였다. 혈액응고 및 혈소판 응집은 aggregometer를 사용하여 측정한 결과 전혈에서 은 나노입자 농도 1, 10, 50 ppm에서 응고가 일어나지 않았으며 PRP 및 WP에서는 1, 2, 4 ppm 농도에서 응집이 일어나지 않았다. PRP 및 WP에서 응집 측정은 은 나노입자의 색을 나타내는 특성으로 최대 농도를 4 ppm으로 설정하였다. 따라서 농도를 높여 현미경으로 관찰해 본 결과 10, 100 ppm의 농도에서도 혈소판 응집이 일어나지 않았다. 혈액 및 혈소판에 agonist(콜라겐, 트롬빈, ADP)를 응집을 일으키지 않는 한계 이하의 농도로 전처리 후 시험을 실시하였을 때에도 역시 응집이 일어나지 않았다.
이상의 연구 결과를 종합하면, 구연산 캡핑된 은 나노입자는 5% 포도당 용액 및 2% 글리세롤 용액에서 안정된 상태로 존재하여 은 나노입자의 정맥주사용 제제에 적당한 용매로 사용할 수 있었다. 혈소판 응집 시험에 사용되는 시험용제(DW, FBS, WPB)에서도 은 나노입자는 시험기간 동안 안정하였다. 은 나노입자는 정맥투여 하였을 때 혈중 은 농도가 투여 5분 후 최고 농도에 이르렀으며 투여 28일 후에는 최고농도의 90%가 감소하였다. 은 나노입자와 은 이온의 생체이용률을 비교하기 위해 경구투여 후 혈중농도와, 조직축적, 배설을 측정한 결과 은 나노입자 투여군의 경우 대변으로의 배설이 높으나 은 이온의 경우 소변으로의 배설이 상대적으로 높았고 간, 신장, 폐 장기로의 축적은 은 이온에서 높게 나타나는 것으로 보아 은 나노입자는 은 이온에 비해 위장관에서의 흡수율이 낮은 것으로 판단되었다. 임신한 어미 랫드에 은 나노입자를 만성적으로 경구투여한 후 태자의 간, 신장, 폐, 뇌에서 은 농도를 측정한 결과 은 이온이 축적되는 것을 확인하였으며 이러한 결과로 보아 은 나노입자는 모체에서 태자로 이행되는 것으로 확인되었다. 또한 은 나노입자는 혈소판응집 및 혈액응고 작용이 없었다. 이러한 연구결과는 나노입자의 물리 화학적 성질과 독성과의 상관관계, 생체이용률과 독성과의 상관관계 등을 규명하는데 도움이 될 뿐만 아니라 나노 입자의 위해성평가 연구의 기반을 제공할 것으로 기대된다.

Citrate-capped silver nanoparticles (AgNPs) are widely used in industry, consumer products and medical appliances. However, information on the toxicity, environmental fate and toxicokinetics are not enough. In this study, stability, toxicokinetics and effects in blood coagulation and platelet aggregation of AgNPs were investigated.
Stability of citrate-capped AgNPs was investigated in different types of isotonic solution, which is important in the toxicokinetic study by intravenous injection. Size, morphology, zeta potential and ion formation were analysed in isotonic solutions for the physico-chemical characterization of AgNPs. Aggregation and precipitation of AgNPs were observed in saline or phosphate-buffered saline while they were stable in 5% glucose and 2% glycerol of isotonic solution. The average size of AgNPs in 5% glucose solution and 2% glycerol solution was ranged from 6 to 10 nm, which was almost same as those in water-based suspension of AgNPs. Zeta potential was ranged from -30 mV to -60mV, which was in the range of original stock AgNPs. The stability was maintained during the whole experimental period of 48 hours. Furthermore, the stability was maintained in different temperature (10℃, 25℃, and 36℃) with different concentrations (10 ~ 1,000 ppm). The osmolarity of the AgNPs suspension was 299±1 mOsm/kg which was in isotonic range. These results suggest that AgNPs in 5% glucose solution and 2% glycerol solution can be used for the preparations of intravenous injection for toxicokinetic study without undesired disturbance of blood isotonicity.
Serum kinetics of AgNPs were investigated in rabbits (n=4) up to 28 days after a single intravenous injection. Following a single injection of AgNPs, the AUC(last) was 3.65±0.68 μg·day/mL in 5 mg/kg ? treated group and 0.90±0.16 μg·day/mL in 0.5mg/kg ? treated group. Serum kinetics, tissue distribution, and excretion of AgNPs and silver ion (AgNO3) were investigated in rats (n=5) up to 24 hours after a single oral administration. Following a single administration of silver, the AUC was 3.81±0.57 μg·day/mL in 20 mg/kg AgNO3-treated group and 1.58±0.25 μg·day/mL in 20 mg/kg AgNPs-treated group, respectively. Tissue distribution of silver was determined in liver, lung and kidney. The accumulation of silver was observed in the tissues of respective organs in the treated rats (both AgNO3 and AgNPs) at 1day. The liver was a major target because of high accumulation (both AgNO3 and AgNPs). Excretion via feces and urine was also monitored during the whole experimental days. The excretion of silver through urine was higher in AgNO3 treated group, while the excretion of silver through feces was higher in AgNPs treated group. Silver nanoparticles (size: 7.9±0.95 nm, dosage: 250 mg/kg) were orally administered to pregnant rats. At 4 days after parturition, four pups were randomly selected (one pup from one dam) and silver level in liver, kidney, lung and brain was determined by ICP-AES and electron microscope. As results, silver nanoparticles highly accumulated in the tissues of the pups. Silver level in the treated group was 132.4±43.9 ng/g in the kidney (12.3 fold compared to control group), 37.3 ±11.3 ng/g in the liver (7.9 fold), 42.0 ±8.6 ng/g in the lung (5.9 fold), and 31.1±4.3 ng/g in the brain (5.4 fold). This result suggested that the possible transfer of silver nanoparticles from pregnant dams to the fetus through mainly placenta.
Effects of AgNPs on the blood coagulation and platelet aggregation were also investigated using diluted whole blood, platelet rich plasma (PRP) and washed platelet of SD male rats. To confirm the stability of AgNPs in the test, size distribution of the nanoparticles were measured in the vehicles including distilled water, serum, and platelet buffers. The average size of AgNPs was 20 nm in the vehicles, which means that the stability was maintained during the whole experimental period. When blood coagulation was monitored by using whole blood impedance aggregometer, coagulation was not observed at the concentration of 1, 10 and 50 ppm. Platelets in plasma or in buffer were not aggregated by AgNPs at the concentration of 1, 2 and 4 ppm, respectively. The test concentration of AgNPs could not be increased because the dark color of the nanoparticles impeded the transmission of light, which is an indicator of aggregation. Although the blood or platelets were pre-activated by collagen, thrombin, or ADP with sub-threshold level, aggregation was not observed at the test concentration. Microscopic observation also supported the result obtained by the aggregometer.