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논문 기본 정보
- 자료유형
- 학위논문
- 저자정보
- 지도교수
- 柳鏞萬
- 발행연도
- 2014
- 저작권
- 충남대학교 논문은 저작권에 의해 보호받습니다.
이용수2
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RNA interference(RNAi)는 살아있는 세포 내에서 유전자의 표현 형을 억제하는 방법이다. Chitinase는 곤충이 탈피를 하는 동안 오 래된 큐티클의 분해와 재흡수를 도와주는 효소이다.
담배거세미나방의 chitinase와 관련하여 탈피 저해 효과를 조사 하기 위해 담배거세미나방 5령 유충으로부터 RNA를 추출 하였다. RNA를 이용하여 cDNA를 합성하고 약 700bp의 chitinase를 증폭 하였다. 증폭한 PCR product를 pGEM T-easy vector에 cloning하여 competent cell(E.coli)에 형질전환 시키고 mixture를 배양한다. 배양 후 colony를 선발하고 plasmid DNA를 추출하였다. 추출한 plasmid DNA에 chitinase gene이 있는지 없는지 확인하기 위해 EcoR I을 이용하여 제한효소 처리를 하였다. 그 결과 약 3kb size의 vector band와 약 700bp의 insert band를 확인 할 수 있었다. dsRNA를 합성하기 위해 각각의 DNA를 Spe I과 Nco I의 제한 효소 처리를 하여 linear form의 DNA로 만들었다. dsRNA 합성 후 약 10μg/μl 의 농도로 5μl씩 담배거세미나방 4령 유충에 주입하였다.
그 결과 유충-유충 간의 탈피에서는 기형발육, 탈피저해, 표피의 색소 변이가 나타났다. 번데기-성충 간의 탈피에서는 탈피저해, 날개변이, 기형발육 현상을 볼 수 있었다.
용화율의 경우 무처리구 83.33%, DW 처리구 78.33%, dsRNA 처리구 66.67%로 나타났다. 우화율의 경우 무처리구 90.00%, DW 처리구 72.34%, dsRNA 처리구 65.00%로 나타나 dsRNA를 처리한 그룹에서 상대적인 탈피 저해 효과를 확인할 수 있었다. 그러나 변이율의 경우 무처리구 8.89%, DW 처리구 2.94%, dsRNA 처리구 19.23% 로 dsRNA를 주입한 처리구에서 변이율이 가장 높게 나타난 것을 확인할 수 있었다. 표현형적 변이는 dsRNA 주입 후 약 18 시간 이후부터 뚜렷하게 나타나는 것을 볼 수 있었다. mRNA 발현량의 비교 분석을 위해서는 PCR과 real-time PCR을 이용 하였고, standard gene으로 actin을 사용하였다. Sample은 non-injection 6h, 12h, 18h, 24h과 DW 6h, 12h, 18h, 24h 그리고 dsRNA 6h, 12h, 18h, 24h를 사용하였다. PCR 후 전기영동을 하였을 때, actin의 발현은 거의 일정한 band를 보여주었다. 하지만 chitinase의 경우 non-injection sample의 경우 band가 비교적 굵게 나타났지만 DW sample의 경우는 12h 이후로 band의 굵기가 얇게 나타났다. dsRNA sample의 경우에는 6h에는 band가 보이지 않았고 나머지 band 역시 non-injection에 비해 희미한 것을 확인할 수 있었다.
그러나 real-time PCR 결과를 보았을 때는 조금 다른 양상을 볼 수 있었다. Non-injection 그룹에 비해 DW, dsRNA를 처리한 그룹 에서 mRNA 발현량이 낮게 나타난 것을 알 수 있었지만 그 차이가 크지는 않았다. 또한 특이적으로 dsRNA의 12h sample에서 mRNA 발현량이 높게 확인되었다.
담배거세미나방의 chitinase와 관련하여 탈피 저해 효과를 조사 하기 위해 담배거세미나방 5령 유충으로부터 RNA를 추출 하였다. RNA를 이용하여 cDNA를 합성하고 약 700bp의 chitinase를 증폭 하였다. 증폭한 PCR product를 pGEM T-easy vector에 cloning하여 competent cell(E.coli)에 형질전환 시키고 mixture를 배양한다. 배양 후 colony를 선발하고 plasmid DNA를 추출하였다. 추출한 plasmid DNA에 chitinase gene이 있는지 없는지 확인하기 위해 EcoR I을 이용하여 제한효소 처리를 하였다. 그 결과 약 3kb size의 vector band와 약 700bp의 insert band를 확인 할 수 있었다. dsRNA를 합성하기 위해 각각의 DNA를 Spe I과 Nco I의 제한 효소 처리를 하여 linear form의 DNA로 만들었다. dsRNA 합성 후 약 10μg/μl 의 농도로 5μl씩 담배거세미나방 4령 유충에 주입하였다.
그 결과 유충-유충 간의 탈피에서는 기형발육, 탈피저해, 표피의 색소 변이가 나타났다. 번데기-성충 간의 탈피에서는 탈피저해, 날개변이, 기형발육 현상을 볼 수 있었다.
용화율의 경우 무처리구 83.33%, DW 처리구 78.33%, dsRNA 처리구 66.67%로 나타났다. 우화율의 경우 무처리구 90.00%, DW 처리구 72.34%, dsRNA 처리구 65.00%로 나타나 dsRNA를 처리한 그룹에서 상대적인 탈피 저해 효과를 확인할 수 있었다. 그러나 변이율의 경우 무처리구 8.89%, DW 처리구 2.94%, dsRNA 처리구 19.23% 로 dsRNA를 주입한 처리구에서 변이율이 가장 높게 나타난 것을 확인할 수 있었다. 표현형적 변이는 dsRNA 주입 후 약 18 시간 이후부터 뚜렷하게 나타나는 것을 볼 수 있었다. mRNA 발현량의 비교 분석을 위해서는 PCR과 real-time PCR을 이용 하였고, standard gene으로 actin을 사용하였다. Sample은 non-injection 6h, 12h, 18h, 24h과 DW 6h, 12h, 18h, 24h 그리고 dsRNA 6h, 12h, 18h, 24h를 사용하였다. PCR 후 전기영동을 하였을 때, actin의 발현은 거의 일정한 band를 보여주었다. 하지만 chitinase의 경우 non-injection sample의 경우 band가 비교적 굵게 나타났지만 DW sample의 경우는 12h 이후로 band의 굵기가 얇게 나타났다. dsRNA sample의 경우에는 6h에는 band가 보이지 않았고 나머지 band 역시 non-injection에 비해 희미한 것을 확인할 수 있었다.
그러나 real-time PCR 결과를 보았을 때는 조금 다른 양상을 볼 수 있었다. Non-injection 그룹에 비해 DW, dsRNA를 처리한 그룹 에서 mRNA 발현량이 낮게 나타난 것을 알 수 있었지만 그 차이가 크지는 않았다. 또한 특이적으로 dsRNA의 12h sample에서 mRNA 발현량이 높게 확인되었다.
목차
Ⅰ. Introduction 1Ⅱ. Materials and Methods 41. Insect 42. Total RNA Isolation and cDNA Synthesis 43. Amplication of chitinase gene 54. Chitinase Cloning 74-1. pGEMⓡ T-easy vector ligation 74-2. Transformation 74-3. Spreading 84-4. Colony Picking 84-5. Plasmid DNA extraction 94-6. Check insertion with EcoR I 105. dsRNA Synthesis 115-1. Enzyme cutting with Spe I and Nco I 115-2. Purification 115-3. dsRNA Synthesis 126. RNA interference Bioassay 137. Analysis of expression level 147-1. Electrophoresis 147-2. Analysis of Real-time PCR 16Ⅲ. Results 171. Total RNA Isolation, cDNA Synthesis and Amplification of Chitinase gene 172. Chitinase Cloning 193. Synthesis of dsRNA 223-1. Enzyme cutting with Spe I and Nco I 223-2. Synthesis of dsRNA 234. RNA interference Bioassay 244-1. Phenotypic Observation: larva 244-2. Phenotypic Observation: Adults 264-3. The change of expression pattern on dsRNA by time: Phenotypic observation 315. Analysis of expression level 345-1. Electrophoresis 345-2. Analysis of Real-time PCR 36Ⅳ. Discussion 38Ⅴ. Reference 40Ⅵ. Abstract 45
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