Expression of Membrane Fusion Related Genes in Mouse Ovary :생쥐 난소에서 막 융합 관련 유전자들의 발현양상

정복해

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자료유형: 학위논문

저자정보: 정복해 (남서울대학교, 남서울대학교 대학원)

지도교수: 박창은

발행연도: 2014

저작권: 남서울대학교 논문은 저작권에 의해 보호받습니다.

이용수9

이 논문의 연구 히스토리 (2)

2016

Expression of Membrane Fusion Related Genes in Mouse Ovary

정복해 , 성현호 , 박창은 대한임상검사과학회지 2016.01 학술저널

2014

Expression of Membrane Fusion Related Genes in Mouse Ovary

정복해 임상병리 2014.01 학위논문

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포유류의 난소에서 과립막 세포 (granulosa cells)는 난포내 난자를 둘러싸고 난자 뿐만 아니라 난포의 발달에 필요한 상태를 만드는데 중용한 역할을 한다, 그리고 협막세포 (theca cells) 등의 성장과 분화를 조절하는 매우 복잡한 과정이다.
본 연구의 목적은 성장이 정지되어 있는 원시난포에서 성장이 개시되는 1차난포, 2차난포로 전환하는 동안에 관여하여 발현하는 유전자를 조사하는 것이다. 본 연구에서는 5일자, 12일자 난소로부터 총 리보핵산을 추출하여 동량의 RNA로부터 cDNA를 합성하여 ACP-PCR을 수행하였다. ACP-PCR은 annealing과정에서 특이하게 감도를 높이는 기술로 서로 다르게 발현하는 유전자들 (DEGs)을 발굴하는 것이다, 40종의 primer를 이용해 증폭된 산물은 클로닝과 BLAST를 통한 염기서열 분석을 통해 8개의 DEGs를 발굴하였다. 이 중 2개를 in situ hybridization을 통해 확인하였다 Plekha5와 Anxa11는 5일자 난소에서 높게 나타났으며 특히 난자핵과 세포질에서 높게 발현하였다. 이에 반해 과립막 세포에서는 난포발달단계에 따라 증가하는 양상을 보였다. 향후에는 각 난포를 분리하여 그 기능연구를 수행해야 할 것이다.
본 연구에서 성공적으로 5일, 12일 난소에서 서로 다르게 발현하는 발현유전자 목록을 일부 찾았다. 이 유전자 발현 정보는 원시난포의 개시와 성장을 위한 전환에 관여하는 기전을 이해하는데 기초정보를 제공할 것이다. 따라서 이들은 막융합과 이온 수송 등을 통해 난소의 난포발달과정에서 시간적-공간적인 조절 기전에 의해 이루어 질것으로 보인다. 이에 난포발달 촉진을 위한 난소기능부전의 기전을 규명하는데 정보를 제공할 것으로 기대된다.

The granulosa cells surround the oocyte within the ovarian follicle and play an essential role in creating conditions required for oocyte as well as follicular development. The present study was conducted to investigate gene expression profile of mouse ovaries during the primordial to primary follicle transition process. Total RNAs from mouse ovaries at day 5 and day 12 and synthesized cDNA using annealing control primers. The ACP provides annealing specificity and sensitivity to the template and allows the identification of only authentically differentially expressed genes (DEGs). Among 40 ACPs used in PCR reaction, 8 DEGs were cloned into TOPO-TA cloning vector, which were subsequently sequenced and their identities were analyzed by BLAST search. Sequences of 8 clones significantly matched the database entries. Differential expression of selected DEGs was confirmed using in situ hybridization analysis. The Plekha5 and Anxa11 were highly expressed in day 5 ovary which showed that most of the genes were expressed in the oocytes at the primary follicle stage. By contrast, their expression was increased in granulosa cells at the primary follicle stage. Differential expression of Plekha5 and Anxa11 between primordial and primary follicles was further confirmed by using follicle isolations. We have successfully discovered list of genes expressed in day 5 and day 12 ovaries and confirmed that some of them are differentially expressed in PMF and/or PRI. Gene expression profile from the present study would provide insight for the future study on the mechanism(s) involved in primordial-primary follicular transition. This is a spatial-temporal regulatory mechanism on the ovarian folliculogenesis through the membrane fusion and regulation of ion transport system. To identify future features in ovarian dysfunction to promote follicular development is to use the information.

Key words : Ovarian development, Membrane fusion, in situ hybridization

ABSTRACT
TABLE OF CONTENTS
LIST OF FIGURES
LIST OF TABLES
ABBREVIATION
Ⅰ. INTRODUCTION 1
1. Background 1
2. Purpose 8
Ⅱ. MATERIALS AND METHODS 9
1. Source of tissues 9
2. mRNA isolation and first-strand cDNA synthesis 9
3. Amplification of cDNA target sequence and cloning 10
4. Tissue preparation and in situ hybridization 11
5. Real-time PCR 12
6. Immunohistochemistry 14
7. Statistical analysis 14
Ⅲ. RESULTS 15
1. Histological appearance of primordial?primary Follicle transition and developmental stages in the mouse ovary 16
2. Typical expression of DEGs, list up by ACP-PCR 17
3. RNA localization of DEGs by in situ hybridization 20
4. mRNA expression patterns of DEGs in postnatal ovary stages using real-time PCR 22
5. Expression of PLEKHA5 protein by immunohistochemistry analysis 24
Ⅳ. DISCUSSION 26
Ⅴ. CONCLUSION 31
REFERENCES 32
국문요약 39
감사의 글 41

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