연골세포와 중간엽줄기세포의 3차원 co-culture를 통한 연골화 향상 :

황슬기

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자료유형: 학위논문

저자정보: 황슬기 (인하대학교, 인하대학교 대학원)

지도교수: 김동일

발행연도: 2015

저작권: 인하대학교 논문은 저작권에 의해 보호받습니다.

이용수9

이 논문의 연구 히스토리 (2)

2016

연골세포와 중간엽줄기세포의 3차원 Co-culture를 통한 연골화 향상

황슬기 , 차현명 , 임진혁 외 3명 KSBB Journal 2016.06 학술저널

2015

연골세포와 중간엽줄기세포의 3차원 co-culture를 통한 연골화 향상

황슬기 일반 2015.01 학위논문

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고령화 사회에 접어들면서 퇴행성 관절염 환자가 늘어나고 있고, 이를 치료하기 위한 세포치료제의 개발이 이루어지고 있다. 현재 퇴행성 관절염 치료를 위해 연골세포와 중간엽줄기세포(mesenchymal stem cells, MSCs)를 각각 이용한 세포치료제가 사용되고 있지만, 치료에 필요한 충분한 양의 연골세포의 확보가 어려운 상황이다. 이러한 문제를 해결하기 위해, 증식률을 높이는 여러 가지 세포 배양 방법이 연구되고 있다. 일반적으로 세포 증식에 사용되는 2차원 배양 방법은 연골세포와 줄기세포의 특성을 감소시키고 배양 면적이 제한적이다. 따라서 생체 내의 환경을 재현할 수 있고, 세포의 특이적 성질도 향상시키면서 효율적인 scale-up이 가능한 3차원 배양 방법의 개발이 필요하다.
연골세포와 MSCs를 co-culture하면, 세포간 상호작용으로 인해 증식률과 연골 세포의 형성이 증대된다. 하지만 연골세포와 MSCs를 3차원으로 co-culture하면, 세포의 aggregation으로 형성된 sphere의 크기가 증가함에 따라 물질 전달력이 감소하고 각각의 sphere를 구성하는 세포의 비율이 다를 수 있다.
본 연구에서는 연골세포와 MSCs로 구성되고 크기와 세포 비율이 조절된 sphere를 3차원 co-culture에 이용하는 방법을 확립하여 연골화를 향상시켰다. 본 연구에 사용한 MSCs는 골막 유래 전구세포(periosteum-derived progenitor cells, PDPCs)로 골막의 형성층에서 유래한 세포이며 관절연골 치료의 세포자원으로 이용하기 적합한 세포주이다. 연골세포와 PDPCs의 3차원 co-culture는 먼저 각각의 세포를 3:7의 비율로 혼합한 후, Perfecta3D® 96-well hanging drop plate의 각 well에 같은 양의 세포수로 접종하고 3일간 sphere를 유도하였다. 각 well마다 형성된 sphere를 세포 부착 유도인자가 없는 35-mm culture dish에 3.84 × 105 cells/mL의 농도로 접종한 후, rotation platform에서 연골 분화배지를 사용하여 60 rpm으로 배양하였다. 위와 같은 방법으로 배양한 결과, 기존의 2차원 배양 방법보다 단위 면적당 배양 가능한 세포수가 증가하였으며, 연골 형성 능력이 증대되었다.
결과적으로, 본 연구를 통해 연골세포와 MSCs를 새로운 방법으로 3차원 co-culture하여 연골화를 향상시켰다. 이 3차원 co-culture 방법은 효율적인 scale-up이 가능하고, 연골 형성 능력을 증가시킬 수 있다. 따라서 퇴행성 관절염 세포치료제로 사용이 가능한 충분한 연골세포를 확보할 수 있는 가능성을 확인하였다.

As an aging society, the number of osteoarthritis patients has increased steadily in Korea. So several ways of treatments have been used and developed for the repair of degenerative arthritis. There are cell therapies with using chondrocytes or mesenchymal stem cells (MSCs), however, obtaining sufficient numbers of cells for the treatments is usually difficult. To overcome this shortage problem, diverse culture methods are investigated for enhancing proliferation of cells. Two dimensional (2D) cultivation is typically used for cell growth, but the method reduces the characteristics of chondrocytes and stem cells, and limits culture area. Therefore, development of three dimensional (3D) culture method is needed to mimic in vivo environment, improve quality of cells and scale-up efficiently.
Improving proliferation and chondrogenesis is available by co-culture of chondrocytes and MSCs that leads to interaction between two kinds of cells. However, the co-culture has problems that permeability of sphere diminishes as aggregate size increased and ratio of two kinds of cells composing each spheres is different.
In this work, co-cultivating method using controlled sphere composed of chondrocytes and MSCs was established and enhanced chondrogenesis. Periosteum-derived progenitor cells (PDPCs) that are appropriate for cell therapy source of articular cartilage were used as MSCs. Controlled spheres were formed in Perfecta3D® 96-well hanging drop plates in 3 days and shifted for being induced chondrogenesis in 35-mm non-adhesive culture dishes at a rotation rate of 60 rpm. After two weeks later, gene expressions related with chondrogenesis were found to be improved and it was apparent that the utilization of controlled spheres promoted chondrogenesis. As a result, available numbers of cells per unit area were increased and chondrogenic differentiation ability was improved compared to typical 2D culture.
In conclusion, 3D co-culture system for efficient scaling-up and enhancing chondrogenesis was developed in this study. This approach shows the potential in cartilage regeneration as it can provide sufficient numbers of chondrocytes.

#중간엽줄기세포 #연골세포 #세포배양

1. 서 론 1
1.1 조직공학 및 재생의학 1
1.2 퇴행성 관절염 세포치료제 1
1.2.1 연골세포 치료제 2
1.2.2 줄기세포 치료제 2
1.2.3 퇴행성 관절염 세포치료의 문제점 3
1.3 연골 8
1.3.1 연골 조직의 특성 8
1.4 줄기세포 9
1.4.1 성체줄기세포 9
1.4.1.1 중간엽줄기세포 10
1.4.1.2 골막 유래 전구세포 10
1.5 줄기세포 배양 11
1.5.1 2차원 배양 11
1.5.2 3차원 배양 14
1.5.3 Co-culture 14
1.5.3.1 연골세포와 중간엽줄기세포의 3차원 co-culture 15
2. 연구 목적 18
3. 재료 및 방법 19
3.1 연골세포의 분리 및 배양 19
3.2 골막 유래 전구세포의 분리 및 배양 19
3.3 연골세포와 골막 유래 전구세포의 3차원 co-culture 20
3.4 WST-1 assay 21
3.5 면역형광염색(immunofluorescence staining) 21
3.6 역전사 중합효소 연쇄반응(RT-PCR)과 quantitative RT-PCR 21
3.7 Glycosaminoglycan(GAG) assay 22
3.8 Alcian blue staining 23
4. 결과 및 고찰 25
4.1 2차원 co-culture에서 증식 비교 25
4.2 3차원 co-culture 방법 확립 25
4.2.1 연골세포와 골막 유래 전구세포의 비율에 따른 sphere 형성 25
4.2.2 Controlled sphere 형성 26
4.3 연골세포로의 분화 확인 27
4.3.1 배양 방법에 따른 연골세포와 줄기세포 특이 유전자 확인 35
4.3.2 GAG 발현량 확인 38
5. 결 론 40
6. 참고문헌 41

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