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논문 기본 정보
- 자료유형
- 학위논문
- 저자정보
- 지도교수
- 김종국.
- 발행연도
- 2015
- 저작권
- 경북대학교 논문은 저작권에 의해 보호받습니다.
이용수12
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아토피 피부염은 산업화로 인한 환경오염과 현대인의 식생활의 변화 및 기타 스트레스의 증가 등과 더불어 한국을 비롯하여 전 세계적으로도 발병율이 계속 증가하고 있는 과민성 자가 면역질환의 일종으로서 아직까지도 그 정확한 발병원인과 작용기전이 밝혀지지 않고 있는 난치성 만성 알러지 질환 중의 하나이다. 따라서 이에 대한 치료제도 역시 현재까지는 근원적인 치료제는 없는 상황이며 일시적인 병변의 완화를 위해서 대부분 steroid 계통의 약물이나 면역억제제가 주로 사용되고 있는 실정이다. 그러나 이러한 약물을 과다복용하거나 장기간 사용시 인체 면역체계의 이상, 고혈압 및 골다공증의 발생, 어린이 뼈의 성장중지 및 피부위축, 호르몬 이상 등의 다양한 부작용이 많이 발생하고 있기 때문에 보다 안전하고 효과있는 천연물 유래의 치료제 개발이 시급한 실정이다. 아토피 질환의 치료에 효과있는 신규물질을 개발하기 위하여 200종류의 한약재를 대상으로 상황버섯균과 영지버섯균을 이용하여 고체발효를 시켰다. 결과적으로 124종류의 한약재만 성공적으로 발효되었고 나머지 76종류는 세균오염, 한약재 자체의 항균활성, 낮은 영양성, 또는 물리적 특성 등의 원인으로 발효가 어려웠다. 발효된 124종류의 한약재를 대상으로 6종류의 용매(증류수, 메탄올, 에탄올, 아세톤, 에틸아세테이트, 헥산)를 이용하여 추출하고 이들의 항산화효과를 DPPH assay와 FRAP assay를 이용한 방법으로 측정한 결과, 버섯균류의 종류, 추출용매의 종류, 한약재의 종류 등에 따라서 다양한 결과가 나타났다. 발효 후 항산화효과가 증가된 46개 발효시료를 선정하고 이들의 농도에 따른 항산화활성의 영향을 조사하였다. 결과적으로 각 추출물의 농도가 증가함에 따라 유의적으로 활성이 대부분 증가하는 경향을 보였다. 또한 서로 다른 메카니즘의 생리활성효과들이 고체발효를 통해 동시에 모두 증가할 수 있는가를 실험하기 위해 29종류의 한약재를 대상으로 항산화 효과와 항혈전 효과를 동시에 비교 실험을 했다. 결국 4종류의 한약재 고체발효 추출물에서 발효 전 보다 발효 후 항산화 효과와 항혈전 효과가 동시에 모두 증가했다. 아토피 동물 실험을 위해, 우선적으로 발효 후 항산화활성 효과가 더 우수한 9종류의 발효 추출물을 선정하여 DNFB 유도 아토피 동물 모델에 적용을 했다. 실험결과는 3종류의 발효물질(상황발효계피, 상황발효마황, 영지발효복령)에서 DNFB에 의한 염증유도 반응을 현저히 감소시켰다. H&E 염색법을 이용한 조직학적 분석결과, 귀의 비후를 감소시키고 면역세포의 침투효과에 의한 염증반응을 억제하는데도 탁월한 효과를 나타내는 것으로 확인 되었다. 항염증 효과를 재확인하기 위해 상황버섯균으로 발효된 계피를 대상으로 우선 MTT assay를 통해 세포독성이 없음을 확인한 후 염증반응과 관련된 분자마커로서 다양한 matrix metalloproteinase(MMP) 발현에 대한 실험을 한 결과, 발효 전 보다 발효 후 MMP-2, MMP-9, MMP-10 등의 발현이 억제되는 것을 확인했다. 또한 항알러지 효과를 재확인하기 위해 β-Hexosaminidase 생성과 cytokine 발현에 대한 실험을 했다. 결과적으로 β-Hexosaminidase 생성 억제효과가 탁월했고 interleukin-4 (IL-4), interleukin-31 (IL-31)의 발현도 크게 억제되는 것을 확인했다. 현재 산업적 발효법의 대부분은 액체상태의 발효기질 또는 천연물질의 추출물을 세균, 곰팡이, 효모 등을 이용하여 발효시키는 액침발효법(submerged culture)이 널리 이용되고 있다. 그러나 이러한 방법은 특히 한약재처럼 식물을 발효기질로 이용할 경우, 식물세포의 주된 구성성분인 cellulose 성분을 효율적으로 이용하지 못하기 때문에 생물전환(Bioconversion) 효율이 낮은 편에 속한다. 따라서 버섯균류를 이용한 고체발효법은 기존의 액침발효법의 한계를 극복하고 새로운 생리활성물질을 개발할 수 있는 대안이 될 수 있다. 본 연구결과를 통해서 버섯균류를 이용한 한약재의 고체발효를 통해 새로운 항아토피 치료 및 증상완화 물질을 개발할 수 있는 가능성을 제시했으며 향후에 천연물유래의 새로운 생리활성물질 개발 및 약리효능 증대를 위한 중요한 자료로서 그 활용이 기대된다.
목차
I. INTRODUCTION 11. Atopic dermatitis 12. Solid state fermentation 53. The use of mushroom 9Ⅱ. MATERIALS AND METHODS 141. Strains and Medicinal herbs 142. Solid state fermentation 153. Preparation of the extracts of medicinal herbs fermented 154. Measurement of the physiological activity 234-1. Antioxidant activity 234-1-1. DPPH radical scavenging activity 234-1-2. FRAP(the ferric reducing ability of plasma) activity 244-2. Antithrombotic activity 264-2-1. Thrombin inhibition activity 265. Anti-atopic activity in atopic animal model induced by DNFB 275-1. Animals preparation 275-2. DNFB-induced atopic animal model 275-3. Hematoxylin and eosin (H&E) staining 295-4. Measurement of ear swelling and eosinophil count. 295-5. Immunohistochemistry 306. Cytotoxicity assay 307. Gelatin zymography assay 318. Reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) analysis for mRNA expression 329. β-Hexosaminidase assay 3310. Mouse spleen cell culture and measurement of interleukin-4 (IL-4) 3411. Statistical analysis 35III. RESULTS 361. Products of solid state fermentation 362. Extraction of the medicinal herbs fermented in solid state and Construction of the library 363. Comparison of DPPH radical scavenging activity of medicinal herbs fermented in solid state 373-1. Changes of DPPH scavenging activity in 6 kinds of solvents extracts of 124 medicinal herbs fermented in solid state 373-2.Comparison of changes of DPPH scavenging activity according to the concentration-dependency of 46medicinal herbs by solid state fermentation 394. Results of antioxidant activity by FRAP assay 404-1. Results of FRAP assay in 6 kinds of solvents extracts of 124 medicinal herbs fermented in solid state 404-2. Results of FRAP assay of concentration-dependency of 46 medicinal herbs by solid state fermentation 415. Results of antithrombotic activity 1215-1. Changes of thrombin inhibition activity in the methanol extracts of 29 medicinal herbs fermented in solid state 1216. Results of DNFB-induced atopic animal model 1246-1. 9 kinds of medicinal herbs fermented in solid statechosen for atopic animal model experiments 1246-2. Ear swelling assay of 9 kinds of medicinal herbs fermented of atopy induced animal model in C57BL/6 mice by DNFB 1246-2-1. Results by visual observation 1246-2-2. Histological analysis by hematoxylin and eosin(H&E) staining 1257. Measurement of cytotoxicity by MTT assay 1388. Results of Inhibition of various MMP expressions 1388-1. Change of MMP-2 expressionImmunohistochemistry 1388-2. Change of MMP-9 expression by Gelatin zymography assay 1388-3. Reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) analysis for various MMP expressions 1399. Inhibitory effect on cytokine expression 1399-1. Change of β-Hexosaminidase activity 1409-2. Measurement of interleukin-4 (IL-4) 1409-3. Comparison of expression of interleukin-31 (IL-31) by Immunohistochemistry 140IV. DISCUSSION 145V. SUMMARY 156REFERENCES 159ABSTRACT (IN KOREAN) 172
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