세계 5대 슈퍼 푸드로 알려진 렌틸 (Lens culinaris)은 낮은 강수량과 건조한 기후에서도 잘 자라며 수확과 보관이 쉬워 고대 문명 때부터 중요한 식품으로 자리잡아왔다. 렌틸은 단백질, 식이섬유, 엽산, 철분 등 다양한 영양소들이 풍부하게 함유되어 있으며 면역력 증강, 노화 방지, 콜레스테롤의 수치를 낮추어 심혈관계 질환에 좋은 것으로 알려져 있다.
본 연구에서는 총 4종의 렌틸 품종 즉 green, masoor, french, beluga를 대상으로 품종별 렌틸의 항산화 활성을 알아보고 기능성이 우수한 렌틸을 선별하여 산화적 스트레스에 대한 간세포 보호효과에 대한 연구를 진행하였다.
폴리페놀 성분의 추출 수율을 높이기 위해 0.2% HCl이 첨가된 80% methanol을 추출용매로 사용하여 추출한 결과, 본 실험에 사용한 렌틸 4종의 추출 수율은 8.28~15.39%으로 나타났으며, masoor 렌틸이 상대적으로 낮은 추출 수율을 보였다. 이들 추출물을 이용한 항산화 활성 실험에서는 총 폴리페놀 및 플라보노이드 함량, ROS 소거활성 그리고 지질과산화에 미치는 영향을 조사하였다.
총 폴리페놀 함량은 28.39~31.32 mg GAE/g, 플라보노이드 함량은 13.14~16.29 mg QUE/g으로 나타났다. DPPH와 ABTS 라디칼 소거활성은 50%의 라디칼 소거율을 나타내는 IC50로 나타내었으며, 그 결과 DPPH 라디칼에 대한 4종 렌틸 추출물의 IC50는 57.42~64.49 μg/mL, ABTS 라디칼에 대한 IC50는 9.72~72.86 μg/mL로 각각 나타났다. 과산화수소 소거능 실험 결과 4종 렌틸 추출물의 IC50는 59.72~72.86 μg/mL로 나타났다. 앞선 실험에서 상대적으로 높은 라디칼 소거활성을 보인 beluga 렌틸을 이용하여 linoleic acid의 초기 지질과산화와 후기 지질과산화에 대한 저해 효과를 각각 ferric thiocyanate (FTC) 값과 thiobarbituric acid (TBA) 값으로 측정 한 결과, FTC 값에 대한 IC50는 222.76 μg/mL, TBA 값에 대한 IC50는 131.71 μg/mL이었다. 위 결과를 종합해 볼 때, 본 실험에 사용된 4종의 렌틸 추출물은 모두 ROS를 효과적으로 소거하며, 특히 상대적으로 항산화 활성이 우수한 beluga 추출물의 경우 linoleic acid의 초기 및 후기 과산화를 효과적으로 억제하였다.
이와 더불어 마우스 유래의 간세포주인 AML12 세포를 이용하여 산화적 스트레스에 대한 렌틸 추출물의 간세포 보호효과 및 그 작용 기전에 대해 조사하였다. 먼저 마우스 유래의 간세포인 AML12에 대한 렌틸 추출물의 독성 정도를 알아보기 위하여 세포생존율을 실험한 결과 25~100 μg/mL의 농도에서는 세포독성이 나타나지 않았으며, 이에 따라 위 농도 범위에서 다음 실험들을 진행하였다. 산화적 손상을 유발하는 H2O2, alcohol, free fatty acid (FFA)를 간세포에 각각 처리한 후 세포생존율을 확인한 결과, 7 mM의 H2O2를 4시간 처리하여 산화적 손상을 유도하였을 경우 각 렌틸 추출물 (50과 100 μg/mL)을 함께 처리한 세포의 생존율은 추출물을 처리하지 않은 대조군에 비해 유의적인 증가를 보였다. 또한 680 μM의 alcohol을 24시간 처리한 세포에서는 대조군과 비교하였을 때 100 μg/mL의 농도에서만 모든 추출물이 세포생존율을 증가시켰으며, 2.5 mM의 FFA를 24시간 처리한 세포의 경우는 french 렌틸을 제외한 나머지 추출물 100 μg/mL에서 세포생존율의 증가를 보였다. 이로써 50~100 μg/mL 농도의 렌틸 추출물은 산화적 손상을 유발 할 수 있는 다양한 약물에 의한 독성으로부터 간세포의 보호 효과를 가지는 것으로 나타났다.
렌틸 추출물의 처리가 산화적 손상을 유발한 간세포의 생존율을 증가시켰던 결과를 바탕으로 렌틸이 세포내 ROS 생성에 미치는 영향을 알아보았으며, 이는 dichlorofluorescein diacetate (DCF-DA) 염색을 통한 유세포분석법 (fluorescense activated cell sorter, FACS)을 이용하여 진행하였다. 예상대로 H2O2의 처리 후 AML12 세포내 ROS 함량은 현저히 증가하였으나, 렌틸 추출물 처리에 따라 세포내 ROS 함량은 농도 의존적으로 유의적인 감소를 보였다. 이것은 렌틸 추출물이 산화적 손상이 유발 된 간세포에서 세포내 ROS 생성을 효과적으로 억제함으로써 세포 보호효과를 나타내는 것을 시사한다.
따라서 산화적 손상이 유발 된 간세포에서 세포내 ROS 생성을 저해하는 렌틸 추출물의 작용 기전을 확인하고자, 우선 세포내 대표적인 항산화 물질인 glutathione (GSH)의 합성을 비롯하여 세포내 ROS 대사에 관여하는 대표적인 항산화 효소들의 mRNA 발현에 미치는 렌틸 추출물의 영향을 정량 실시간 PCR (quantitative real-time PCR, qPCR) 분석법을 이용하여 분석하였다. 그 결과 렌틸 추출물의 처리에 의해 대조군 대비 발현이 두 배 이상 증가되는 유전자는 GSH 합성에 관여하는 glutamate-cysteine ligase (GCLC), glutamate-cysteine ligase modifier subunit (GCLM), catalase (CAT) 그리고 GSH reductase (GR)로 확인 되었다. 4가지 유전자에 대한 발현 증가는 또한 GSH 함량 측정과 효소 활성 측정을 통해 재확인 하였으며, 그 결과 GSH 함량, CAT 및 GR의 활성 모두가 렌틸 추출물 처리 농도 50과 100 μg/mL에서 농도 의존적으로 유의적인 증가를 보였다.
더 나아가 렌틸 추출물을 전 처리한 AML12 세포에 H2O2로 산화적 손상을 유발하였을 경우 세포내 항산화 시스템을 조사한 결과, 렌틸 추출물 (50과 100 μg/mL)을 함께 처리한 세포내 GSH 함량은 추출물을 처리하지 않은 대조군에 비해 유의적인 증가를 보였다. 그리고 CAT와 GR의 활성은 추출물 농도 50과 100 μg/mL뿐만 아니라 25 μg/mL의 농도에서도 대조군에 비해 유의적인 증가를 보였다. 이상의 결과들은 렌틸 추출물이 간세포 내 GSH의 합성 증가와 CAT 및 GR의 활성 증가를 유도하며, 부분적으로나마, 이를 통해 세포내에 생성되는 ROS를 효과적으로 감소시킴으로써 산화적 손상으로부터 간세포 보호효과를 나타내는 것을 시사한다.
본 연구의 결과를 종합해 보면 4종 렌틸 추출물 중 특히 beluga 렌틸은 ROS 소거활성과 지질에 대한 산화방지 효과가 우수하고, 또한 산화적 손상을 유발한 간세포에서, 부분적으로나마, 세포내 GSH 함량과 대표적 항산화 효소인 CAT와 GR의 활성을 증가시킴으로써 산화적 스트레스로부터 간세포를 효과적으로 보호하는 것을 알 수 있다.

Lentils (Lens culinaris) have been gaining increasing attention recently as one of the top 5 superfoods, and are high in protein and other essential nutrients, including folate, iron, potassium, and antioxidants. A number of studies have indicated that the consumption of lentils was associated with a lower incidence of cancer and also led to improve other chronic diseases such as immune disorder, heart disease, stroke, diabetes, and obesity.
In the present study, phenolic extracts from four different lentil cultivars, green, masoor, french, and beluga, were evaluated for total phenolic contents, in vitro antioxidant activities using reactive oxygen species (ROS) scavenging assays and linoleic acid peroxidation assay, and protective effects against oxidative stress-induced cytotoxicity in AML12 mouse hepatocytes.
Total polyphenols and flavonoids contents of four different lentil extracts were 28.39~31.32 mg GAE/g and 13.14~16.29 mg QUE/g, respectively, and there were no significant differences among the lentil cultivars. IC50 values of the lentil extracts for DPPH radical, ABTS radical, and H2O2 were 57.42~64.49 μg/mL, 66.11~75.69 μg/mL, and 59.72~72.86 μg/mL, respectively. Among the four lentil extracts, beluga extract showed the most potent scavenging effect in all three ROS scavenging assays, and thus beluga extract was further tested for its inhibitory effects on early and late peroxidation of linoleic acid by measuring ferric thiocyanate (FTC) and thiobarbituric acid (TBA) values, respectively. The results showed that the extract significantly inhibited linoleic acid peroxidation in a dose-dependent manner in both early (IC50=222.76) and late (IC50=131.71) phases.
In addition, this study also investigated the protective effect of the four lentil extracts against oxidative stress-induced cytotoxicity in AML12 cells and its underlying mechanisms. H2O2 treatment caused a marked decrease in cell viability, however, pretreatment with the four different lentil extracts for 24 hours at 50 and 100 μg/mL significantly preserved viability of the H2O2-treated cells. Pretreatment with the lentil extracts also increased cell viability in alcohol- or free fatty acid (FFA)-treated AML12 cells, but french lentil extract did it only in alcohol-treated cells. As expected, beluga lentil extract, which showed the most potent cytoprotective effect against the three different types of pro-oxidants, dramatically reduced intracellular ROS levels in a dose-dependent manner in H2O2-treated cells which indicates that beluga lentil extract may exerts its protective effect against H2O2 through decreasing intracellular ROS levels.
To further investigate the mechanism underlying the lentil extract-mediated reduction of intracellular ROS in H2O2-treated AML12 cells, mRNA expression levels of eight antioxidant-related genes were analyzed by a quantitative real-time RT-PCR (qPCR). The expression levels of four genes, glutamate-cysteine ligase (GCLC), glutamate-cysteine ligase modifier subunit (GCLM), catalase (CAT), and glutathione reductase (GR), were found to be increased (>2-fold) by treatment with beluga lentil extract (100 μg/mL) for 24 hours, and these trends in mRNA levels were further reflected in measures of total cellular glutathione (GSH) content and enzymatic activity. Moreover, it was also determined that pretreatment with beluga lentil extract for 24 hours significantly increased the GSH content and enzymatic activities of CAT and GR in H2O2-treated cells, indicating that the extract reduces ROS levels, at least partly, through increasing total GSH content and activities of antioxidant enzymes including CAT and GR in H2O2-treated AML12 cells.
In conclusion, the extracts from the four different lentil cultivars, especially from beluga lentil, exert their in vitro antioxidant activities through scavenging ROS and inhibiting lipid peroxidation. The lentil extracts also exhibited strong protective effect against multiple types of oxidative stress (H2O2, alcohol, and FFA) through reduction of ROS levels, at least partly, via increased expression of antioxidant genes including GCLC, GCLM, CAT, and GR in AML12 cells. Taken together, these results suggest that the lentil extracts represent potential sources of natural hepatoprotective agent and further studies will be required to determine in vivo hepatoprotective effects of the extracts.