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논문 기본 정보
- 자료유형
- 학위논문
- 저자정보
- 지도교수
- 오명주
- 발행연도
- 2018
- 저작권
- 전남대학교 논문은 저작권에 의해 보호받습니다.
이용수10
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본 연구에서는 양식 현장에서 신속한 진단에 용이하게 적용될 수 있는 면역학적 진단법의 개선과 보급을 위한 목적으로 WSSV에 대한 단클론 항체를 제작 한 후 항체의 특성을 평가하였다. WSSV는 세포 배양을 통한 대량생산이 불가능하여 면역항원으로서 WSSV의 재조합 단백질을 생산하고자 하였다. 흰다리새우에서 얻은 WSSV의 VP28유전자를 pET-23(a) 발현 벡터에 클로닝하고 무 세포 단백질 합성 및 정제를 통해 재조합 단백질을 생산하였다. 생산된 재조합 단백질을 SDS-PAGE에서 28 kDa의 분자량을 확인하고 마우스 면역에 항원으로 사용하였다. 재조합 VP28 (rVP28)을 마우스에 면역시킨 후 마우스의 림프절과 SP2/0 myeloma 세포를 융합시켜 hybridoma를 제작하였다. Hybridoma로부터 생성되는 항체를 enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)에 의한 스크리닝을 통해 최종적으로 15개의 단클론항체가 생산되었다.
Western blot에서는 15개 항체 모두 rVP28에 반응 (28 kDa) 하였다. 새우 조직의 경우, 14개의 항체 (1H6, 2G2, 5G2, 15A11, 20G6, 22H7, 31H2, 34H6, 35C9, 38D1, 41B12, 43A1, 44H2, 48A11)는 WSSV 감염 새우의 아가미 조직 (약 25 kDa)에 반응하였고, 정상 새우의 아가미 조직에는 반응하지 않았다. 이중 20G6, 34H6, 43A1 항체는 WSSV에 감염된 새우의 아가미에서 강하게 반응하였다. 46C12 항체는 두 조직 모두에 대해 반응하지 않았다.
ELISA에서는 새우 혈림프에서 13개의 항체 (1H6, 2G2, 5G2, 15A11, 20G6, 22H7, 31H2, 34H6, 35C9, 38D1, 43A1, 44H2, 48A11)가 정상 시료보다 감염 시료에 높은 OD값을 나타내었고, 그 중 4개 (15A11, 20G6, 34H6, 43A1)의 단클론항체가 WSSV 감염 시료에만 높은 OD값을 나타내었다. 41B12와 46C12의 단클론항체는 정상 시료와 감염 시료에서 유사한 OD값을 나타내었다.
Davidson''s AFA로 고정된 아가미 조직에서 H-E염색을 하여 핵내봉입체가 관찰되었고 생산된 15개 단클론항체를 사용하여 IHC를 진행하였다. 10개의 항체 (15A11, 20G6, 22H7, 31H2, 34H6, 35C9, 38D1, 43A1, 44H2, 48A11)는 WSSV에 감염된 새우의 아가미 조직에서 관찰되는 핵내봉입체에 강하게 반응하였고 정상 새우의 아가미 조직에는 반응하지 않았다. 46C12의 단클론항체는 WSSV에 감염된 새우 아가미의 핵내봉입체에만 아주 약하게 반응하였다. 1H6, 5G2의 단클론항체는 WSSV에 감염된 새우의 핵내봉입체에 반응하였으나 정상 새우의 일부 아가미 세포에도 반응하였다. 2G2, 41B12의 단클론항체는 WSSV에 감염된 새우와 정상 새우의 아가미에서 관찰되는 핵내봉입체와 아가미 세포에 모두 반응하였다.
단클론항체 15A11, 20G6, 34H6, 43A1은 ELISA, Western blot, IHC에서 감염 시료에만 강한 면역반응을 하였다. 본 연구를 통해 제작된 단클론항체는 WSSV를 검출하기 위한 진단용 신속진단키트 개발 등에 유용하게 사용될 수 있을 것으로 생각된다.
Western blot에서는 15개 항체 모두 rVP28에 반응 (28 kDa) 하였다. 새우 조직의 경우, 14개의 항체 (1H6, 2G2, 5G2, 15A11, 20G6, 22H7, 31H2, 34H6, 35C9, 38D1, 41B12, 43A1, 44H2, 48A11)는 WSSV 감염 새우의 아가미 조직 (약 25 kDa)에 반응하였고, 정상 새우의 아가미 조직에는 반응하지 않았다. 이중 20G6, 34H6, 43A1 항체는 WSSV에 감염된 새우의 아가미에서 강하게 반응하였다. 46C12 항체는 두 조직 모두에 대해 반응하지 않았다.
ELISA에서는 새우 혈림프에서 13개의 항체 (1H6, 2G2, 5G2, 15A11, 20G6, 22H7, 31H2, 34H6, 35C9, 38D1, 43A1, 44H2, 48A11)가 정상 시료보다 감염 시료에 높은 OD값을 나타내었고, 그 중 4개 (15A11, 20G6, 34H6, 43A1)의 단클론항체가 WSSV 감염 시료에만 높은 OD값을 나타내었다. 41B12와 46C12의 단클론항체는 정상 시료와 감염 시료에서 유사한 OD값을 나타내었다.
Davidson''s AFA로 고정된 아가미 조직에서 H-E염색을 하여 핵내봉입체가 관찰되었고 생산된 15개 단클론항체를 사용하여 IHC를 진행하였다. 10개의 항체 (15A11, 20G6, 22H7, 31H2, 34H6, 35C9, 38D1, 43A1, 44H2, 48A11)는 WSSV에 감염된 새우의 아가미 조직에서 관찰되는 핵내봉입체에 강하게 반응하였고 정상 새우의 아가미 조직에는 반응하지 않았다. 46C12의 단클론항체는 WSSV에 감염된 새우 아가미의 핵내봉입체에만 아주 약하게 반응하였다. 1H6, 5G2의 단클론항체는 WSSV에 감염된 새우의 핵내봉입체에 반응하였으나 정상 새우의 일부 아가미 세포에도 반응하였다. 2G2, 41B12의 단클론항체는 WSSV에 감염된 새우와 정상 새우의 아가미에서 관찰되는 핵내봉입체와 아가미 세포에 모두 반응하였다.
단클론항체 15A11, 20G6, 34H6, 43A1은 ELISA, Western blot, IHC에서 감염 시료에만 강한 면역반응을 하였다. 본 연구를 통해 제작된 단클론항체는 WSSV를 검출하기 위한 진단용 신속진단키트 개발 등에 유용하게 사용될 수 있을 것으로 생각된다.
목차
Ⅰ. 서론 1Ⅱ. 재료 및 방법 31. WSSV VP28 재조합 단백질 제작 3가. WSSV DNA 준비 3나. Polymerase chain reaction (PCR) 3다. TA 클로닝 및 염기서열 분석 3라. pET벡터 클로닝 4마. 무 세포 단백질 합성 (Cell-Free Protein expression) 및 정제 4바. 재조합 단백질 분석 42. 재조합 WSSV VP28에 대한 단클론항체 생산 6가. 면역 및 세포융합 6나. Hybridoma 선별 63. 단클론항체의 특성조사 7가. 시료준비 7나. Western blot 7다. Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) 8라. 면역조직화학 (Immunohistochemistry, IHC) 8마. 단클론항체의 Isotyping 9Ⅲ. 결과 101. 재조합 WSSV VP28에 대한 단클론항체 생산 10가. WSSV PCR 및 염기서열 분석 10나. 재조합 단백질 분석 10다. 면역 및 Hybridoma 선별 102. 단클론항체의 특성조사 11가. WSSV 인위감염 실험을 통한 시료준비 11나. Western blot을 이용한 단클론항체의 특성조사 11다. ELISA를 이용한 단클론항체의 특성조사 11라. IHC를 이용한 단클론항체의 특성조사 12마. 단클론항체의 isotype 12Ⅳ. 고찰 25Ⅴ. 참고문헌 29Abstract 32
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