섬개야광나무(Cotoneaster wilsonii Nakai) 잎 추출물의 생리활성 및 유효성분 분리 :Sutdies on Bioactivities and Isolation of Active Compound from Cotoneaster wilsonii Nakai Leaf Extract

유남호

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자료유형: 학위논문

저자정보: 유남호 (강원대학교, 강원대학교 대학원)

지도교수: 김명조

발행연도: 2020

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이용수7

이 논문의 연구 히스토리 (2)

2020

섬개야광나무(Cotoneaster wilsonii Nakai) 잎 추출물의 생리활성 및 유효성분 분리

유남호 농학과 2020.01 학위논문

2019

섬개야광나무 잎 추출물 및 분획물의 생리활성 평가 및 활성 물질 분리

유남호 , 김희규 , 송재모 외 7명 한국약용작물학회지 2019.12 학술저널

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섬개야광나무(Cotoneaster wilsonii Nakai)는 장미과(Rosaceae)의 낙엽관목으로 울릉도 해안가 절벽 및 바위 지대에서 자라는 한국 고유종으로써 환경부 멸종위기 2급 식물이다. 본 연구에서는 섬개야광나무 잎 추출물 및 분획 층을 이용하여 항산화, 항염, 미백, 주름개선, 항암의 활성을 검정하고 천연물 소재로서의 이용 가능성을 밝히고, 이에 대한 과학적 근거를 제시하고자 하였다. 섬개야광나무 잎 추출물 및 분획물에 대한 DPPH free radical 소거 활성을 측정한 결과 EtOAc (ethyl acetate) 분획 층에서 9.69±0.45 ㎍/㎖의 IC50 값을 가짐으로써 항산화제로 사용되는 α-tocopherol, 3-tert-butyl-4-hydroxyanisole (BHA), 2,6-di-tert-butyl-4-methylphenol (BHT) 보다 높은 활성을 나타내었다. 총 페놀 및 플라보노이드 함량도 345.98±1.98 ㎎?GAE/g, 74.23±2.67 ㎎?QE/g으로 높은 함량을 나타내었다. HPLC를 이용하여 6가지 페놀성 화합물을 분석한 결과 chlorogenic acid가 84.24±0.64 mg/g Ext.로 가장 높은 함량을 나타내었다. 또한 환원력 측정에서는 500, 1000 ㎍/㎖에서 ascorbic acid와 유사한 활성을 보였다. 따라서 섬개야광나무 잎이 높은 항산화력을 가지는 것을 확인하였다. 항염 활성을 확인하기 위해 RAW 264.7 대식 세포에 LPS로 자극을 유도하여 NO 생성량을 측정한 결과 EtOAc 분획 층 200 ㎍/㎖에서 40.44%까지 NO 생성을 억제하였다. 또한 mRNA 발현에서도 iNOS와 TNFα 유전자가 감소되어 섬개야광나무 잎이 염증 억제에 효과가 있는 천연물로 이용될 수 있는 가능성을 확인하였다. Tyrosinase 효소를 이용한 미백 효과를 확인하였을 때 농도 의존적으로 효과가 증가하였다. EtOAc 분획 층의 경우 1000 ㎍/㎖에서 positive control인 kojic acid와 비슷한 활성을 나타내었다. Elastase 효소를 이용한 주름개선 효과에서는 n-hexane 분획 층이 가장 높은 활성을 나타내었다. 항암 활성을 확인을 위하여 정상세포인 HEK 293 신장 세포를 이용하여 세포 독성을 확인하였을 때 n-hexane 분획 층은 독성이 있음을 확인하였으며, 실험 대상인 7개의 암세포들 중에서 자궁경부암 세포인 HeLa 세포에서 methanol 추출물이 가장 높은 효과를 나타내었다. 이에 따라 높은 항산화력과 항염 활성을 가지는 EtOAc 분획 층을 대상으로 물질을 분리하였으며. (+)-catechin으로 동정 되었다. DPPH free radical 소거활성을 측정한 결과 16.05±0.20 μmol의 IC50값을 나타냈으며, NO 생성을 확인하였을 때 농도 의존적으로 감소하는 것을 확인하였다. 또한 mRNA를 이용한 RT-PCR 결과 섬개야광나무 잎 추출물과 마찬가지로 iNOS 및 TNFα 유전자가 감소하는 것을 확인하였다. 섬개야광나무 잎 추출물 및 분획 층에 대한 생리활성 검정 결과, 항산화 및 항염에서 높은 효과를 나타내었으며 미백, 주름개선, 항암 효과를 확인하였다. 따라서 섬개야광나무 잎이 항산화제, 항암치료제 및 기능성 제품 원료 등에 이용 및 개발 될 수 있다고 판단되며 이에 따른 기초자료를 제시하였다.

Cotoneaster wilsonii Nakai is deciduous shrub of the Rosaceae. The Ministry of Environment in Korea, C. wilsonii recognizes as a second-class endangered plant. It is a native species that grows in Ulleung-do, Korea. In this study, using the leaf extract from the C. wilsonii, the activity of anti-oxidant, anti-inflammatory, anti-cancer, whitening and anti-wrinkle were determined and these results can provide scientific evidence for the possibility of development as a natural material. The biological activities of extract and fractions from C. wilsonii were investigated in vitro. In 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) free radical inhibition assay, ethyl acetate (EtOAc) fraction (9.69±0.45 ㎍/㎖) had the higher activity than α-tocopherol (12.33 ㎍/㎖), BHA (16.09 ㎍/㎖) and BHT (127.46 ㎍/㎖). And, it also had the highest total phenolic and flavonoid content (345.98±1.98 ㎎·GAE/g, and 74.23±2.67 ㎎·QE/g extract). Through HPLC (high performance liquid chromatography) analysis, chlorogenic acid was found the highest content (84.24±0.64 mg/g Ext.) among phenolic compounds. In the reducing power assay, it had the similar activity as ascorbic acid at concentration of 500, 1000 ㎍/㎖. Therefore, it was found that the leaf of C. wilsonii had high anti-oxidant activity. To find the activity of anti-inflammatory, nitiric oxide (NO) generation was measured in LPS induced RAW 264.7 cell. NO generation was inhibited to 40.44% in EtOAc fraction with a concentration of 200 ㎍/㎖. And, the iNOS and TNFα primer were reduced. Therefore, the leaf from C. wilsonii would be used as a natural substance to anti-inflammation. In tyrosinase inhibition assay, EtOAc fraction had the similar activity as kojic acid at a concentration of 1000 ㎍/㎖. In elastase inhibition assay, the n-hexane fraction had the highest activity. For finding the anti-cancer activity, the cytotoxicity was confirmed using HEK 293 cell. As a result, the n-hexane fraction had the cytotoxicity. Among the seven cancer cells, the highest activity was found when the methanol (MeOH) extract was treated in the HeLa cell. (+)-Catechin were isolated from the EtOAc fraction that had the high anti-oxidant and anti-inflammatory. In the DPPH free radical inhibition assay, (+)-catechin had an IC50 value of 16.05±0.20 μmol. And, NO generation was decreased as concentration ? dependent. In the RT-PCR, the iNOS and TNFα primer was similary decreased like C. wilsonii leaf. Biological activity of the extract and fractions from C. wilsonii leaf showed high effects on the anti-oxidant and anti-inflammatory. And, it had the whitening, anti-wrinkle and anti-cancer effects. Therefore, the leaf of C. wilsonii can be used and developed as one of the materials for antioxidants, anti-cancer drugs and functional product.

#잎 #자궁경부암 #항산화 #항염 #(+)-Catechin #섬개야광나무

Ⅰ. 서론 1
Ⅱ. 연구사 3
2.1 항산화 3
2.2 항염 4
2.3 미백 및 주름개선 5
2.4 항암 6
Ⅲ. 재료 및 방법 7
3.1 섬개야광나무 잎 추출물 7
3.2 시약 및 기기 7
3.3 분획 및 생리활성 유효성분 분리 8
3.4 항산화 활성 10
3.4.1 DPPH free radical 소거 활성 10
3.4.2 총 페놀 및 총 플라보노이드 함량 측정 10
3.4.3 환원력 측정 11
3.5 HPLC 정성 및 정량 분석 11
3.6 Tyrosinase 저해 활성 12
3.7 Elastase 저해 활성 12
3.8 세포 배양 13
3.9 MTT assay 13
3.10 Nitrite oxide (NO) 생성율 측정 14
3.11 RT-PCR 14
3.12 통계 15
Ⅳ. 결과 16
4.1 항산화 활성 16
4.1.1 DPPH free radical 소거 활성 16
4.1.2 총 페놀 및 총 플라보노이드 함량 측정 16
4.1.3 HPLC를 이용한 섬개야광나무 잎의 페놀성 화합물 정성 및 정량 18
4.1.4 환원력 측정 21
4.2 Tyrosinase 저해 활성 22
4.3 Elastase 저해 활성 23
4.4 섬개야광나무 잎 추출물의 항염 활성 검정 24
4.4.1 Nitric oxide (NO) 생성율 측정 24
4.4.2 RT-PCR을 이용한 iNOS, COX-2, TNFα 유전자 발현 평가 27
4.5 섬개야광나무 잎 추출물의 항암 활성 검정 29
4.6 Compound 1 화합물 35
4.6.1 Compound 1 화합물의 분리 및 구조 동정 35
4.6.2 Compound 1 화합물의 DPPH free radical 소거 활성 37
4.6.3 Compound 1 화합물의 nitric oxide (NO) 생성율 측정 37
4.6.4 RT-PCR을 이용한 Compound 1 화합물의 유전자 발현 평가 39
4.6.5 HPLC를 이용한 섬개야광나무 잎의 Compound 1 화합물 정량 41
4.6.6 Compound 1 화합물의 항암 활성 43
Ⅴ. 고 찰 48
Ⅵ. 결 론 51
참고문헌 52
Abstract 62
Supplemental data 64

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