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논문 기본 정보
- 자료유형
- 학위논문
- 저자정보
- 지도교수
- 조윤래
- 발행연도
- 2020
- 저작권
- 영남대학교 논문은 저작권에 의해 보호받습니다.
이용수16
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본 연구의 목적은 어류 양식업에서 대량 폐사를 유발하는 세균성 질병을 제어하기 위해 항생제가 아닌 단백질성 항균물질을 분리하고, 특성화하였다. 어류병원균인 Vibrio anguillarum을 저해하는 활성 균주를 어류 내장으로부터 분리하였으며, 분리한 활성균주의 생리학적, 생화학적 특성 및 16S rRNA 염기서열을 분석한 결과 Aerococcus urinaeequi IFO12173와 99%의 상동성을 나타내었으며, 분리한 균주를 Aerococcus urinaeequi HS36로 최종 동정하였다. 활성 균주가 접종 후 5시간 이후부터 항균물질을 생산하며, 단백질 분해효소인 proteinase K에 의해 실활되는 것으로 보아 단백질성 항균물질이다. 항균물질은 Sephadex G-100, Sephadex G-25, RP-HPLC를 통해 정제하였으며, 최종 정제된 항균물질의 분자량을 tricine SDS-PAGE를 통하여 약 1000Da으로 확인하였으며, 항균물질의 크기가 비교적 작고, 3차구조가 결여되어 있는 복잡하지 않은 구조 때문에 온도, pH, 금속이온 및 효소저해제에 대해 영향을 많이 받지 않는 것으로 예상된다. β-amylase에 의해서도 분해되는 것으로 보아 당이 혼합된 구조로 예상된다. 뿐만 아니라 Edman degradation에 의해 N-말단 아미노산 서열 분석을 시도하였으나, 최초의 4개의 아미노산(NH2-Phe-Pro-Pro -Gln, FPPQ)만 판독되었으며 5번째 서열부터는 당으로 인하여 Endman 반응을 방해하여 확인할 수 없었다.
따라서 염기서열 확인 및 숙주세포인 Escherichia coli에서의 발현을 위하여 유전자 클로닝을 확인한 결과, 형질전환체에 도입된 유전자의 전체 길이는 약 105bp정도이며, 아미노산서열 FPPQISLPNATVSLN로 확인할 수 있었다. 또한 이 서열의 이론적인 분자량은 1597Da(pI 5.52)이며, cytoplasmic dynein 2 heavy chain 1 isoform X1(Sparus aurata)과 60%의 상동성이 있는 것으로 조사되었다. Escherichia coli에서의 항균 물질 발현은 배양액으로부터 항균물질의 활성을 확인할 수 없었으며, 세포 내에서 활성을 확인할 수 있었다. 이는 세포 외로 분비되기 위한 신호 펩타이드를 가지고 있지 않아 분비되지 않는 것으로 예상된다.
수산양식산업에서 미생물이나 항균물질을 보다 효율적 사용하기 위해서 외부로 유출되지 않고 소실되는 양을 감소시켜 농도를 높게 유지하는 방안으로 규조토를 이용한 기능성 담체를 사용하였다. 혼합배양에서는 담체의 효율성을 확인한 결과에 따르면 균주로 혼합배양 한 것보다 규조토를 담체를 이용한 혼합배양에서 어병균을 잘 제어하는 것을 확인하였다. 또한 시간에 따라 담체를 이용한 혼합배양 한 경우, 4시간 이후에 활성균주가 포함된 담체만 어류 병원균의 성장이 미비한 것으로 보아 활성 균주가 고정된 규조토는 성장하는 어병균을 보다 효율적으로 제어하는 것으로 보인다. 따라서 규조토는 어병균을 제어하기 위해 효과적인 담체로서 미생물과의 부착성이 우수하며 2차 환경오염을 줄일 수 있다는 측면에서 매우 유용할 것으로 사료된다.
따라서 염기서열 확인 및 숙주세포인 Escherichia coli에서의 발현을 위하여 유전자 클로닝을 확인한 결과, 형질전환체에 도입된 유전자의 전체 길이는 약 105bp정도이며, 아미노산서열 FPPQISLPNATVSLN로 확인할 수 있었다. 또한 이 서열의 이론적인 분자량은 1597Da(pI 5.52)이며, cytoplasmic dynein 2 heavy chain 1 isoform X1(Sparus aurata)과 60%의 상동성이 있는 것으로 조사되었다. Escherichia coli에서의 항균 물질 발현은 배양액으로부터 항균물질의 활성을 확인할 수 없었으며, 세포 내에서 활성을 확인할 수 있었다. 이는 세포 외로 분비되기 위한 신호 펩타이드를 가지고 있지 않아 분비되지 않는 것으로 예상된다.
수산양식산업에서 미생물이나 항균물질을 보다 효율적 사용하기 위해서 외부로 유출되지 않고 소실되는 양을 감소시켜 농도를 높게 유지하는 방안으로 규조토를 이용한 기능성 담체를 사용하였다. 혼합배양에서는 담체의 효율성을 확인한 결과에 따르면 균주로 혼합배양 한 것보다 규조토를 담체를 이용한 혼합배양에서 어병균을 잘 제어하는 것을 확인하였다. 또한 시간에 따라 담체를 이용한 혼합배양 한 경우, 4시간 이후에 활성균주가 포함된 담체만 어류 병원균의 성장이 미비한 것으로 보아 활성 균주가 고정된 규조토는 성장하는 어병균을 보다 효율적으로 제어하는 것으로 보인다. 따라서 규조토는 어병균을 제어하기 위해 효과적인 담체로서 미생물과의 부착성이 우수하며 2차 환경오염을 줄일 수 있다는 측면에서 매우 유용할 것으로 사료된다.
목차
1장 어병균 Vibrio anguillalum을 저해하는 균주 분리 및 특성 1Ⅰ. 서 론 2Ⅱ. 재료 및 방법 61. 실험재료 62. 항균물질 생산균주의 분리 및 동정 61) 항균물질 생산균주의 분리 62) 항균물질 생산균주의 동정 93) 항균물질 생산균주의 계대 배양 및 보존 93. 항균물질 생산균주의 특성 111) 항균물질 생산균주의 성장 특성 112) 항균물질 생산균주의 항균활성 측정 113) 균 배양 통기 조건 114) 배양온도에 따른 영향 115) 초기 배양배지의 pH에 따른 영향 116) 탄소원과 질소원에 대한 영향 127) Nine Salt Solution(NSS)의 성분에 따른 활성 영향 128) Proteinase K에 대한 영향 129) 균주의 성장 곡선 12Ⅲ. 결 과 141. 항균물질 생산균주의 분리 및 동정 141) 항균물질 생산균주의 분리 142) 항균물질 생산균주의 동정 142. 항균물질 생산균주의 특성 191) 균 배양 통기 조건 192) 배양온도에 따른 영향 193) 초기 배양배지의 pH에 따른 영향 194) 탄소원과 질소원에 대한 영향 195) NSS의 성분에 따른 활성 영향 206) Proteinase K에 대한 영향 207) 균주의 성장 곡선 20Ⅳ. 고찰 302장. Aerococcus urinaeequi HS36 균주가 생산하는 항균물질 정제 및 특성 32Ⅰ. 서 론 33Ⅱ. 재료 및 방법 361. 항균물질의 정제 361) 항균물질의 생산과 조정제 362) 조정제된 항균물질의 항균활성 측정 363) 유기용매 안정성 364) 단백질성 항균물질의 정제 365) 항균활성력 396) 분자량 측정(Tricine-SDS-PAGE) 392. Aerococcus urinaeequi HS36 균주가 생산하는 항균물질의 특성 391) 온도 안정성 392) pH 안정성 403) 금속이온 및 효소저해제에 대한 영향 404) 효소에 대한 감수성 405) 항균 범위의 측정 406) 항균물질 처리에 의한 형태학적 변화 41Ⅲ. 결 과 421. 항균물질의 정제 421) 조정제된 항균물질의 항균활성 측정 422) 유기용매 안정성 423) 단백질성 항균물질의 정제 454) 항균활성력 455) 분자량 측정 502. Aerococcus urinaeequi HS36 균주가 생산하는 항균물질의 특성 521) 온도 안정성 522) pH 안정성 523) 금속이온 및 효소저해제에 대한 영향 524) 효소에 대한 감수성 525) 항균 범위의 측정 536) 항균물질 처리에 의한 형태학적 변화 53Ⅳ. 고찰 603장. Aerococcus urinaeequi HS36 균주가 생산하는 펩타이드성 항균물질의 유전자 클로닝 63Ⅰ. 서 론 64Ⅱ. 재료 및 방법 671. 균주의 항생제 감수성 시험 672. 유전자 클로닝 671) Chromosomal DNA 분리 672) 제한효소 처리 683) Agarose gel에서 DNA 절편 분리 684) Vector 제한효소 처리 695) DNA ligation 693. 형질전환 691) Competent cell 제조 692) 형질전환 704. 재조합 plasmid의 내재 확인 및 유전자 염기서열 확인 705. 유전자 발현 70Ⅲ. 결 과 731. 균주의 항생제 감수성 시험 732. 유전자 클로닝 733. 재조합 plasmid의 유전자 sequencing 774. 항균물질 유전자 발현 77Ⅳ. 고찰 814장. 미생물 담체를 이용한 효율적인 어병균 제어 83Ⅰ. 서 론 84Ⅱ. 재료 및 방법 871. 담체 내 미생물 군집 형성 872. 미생물 담체의 항균활성 확인 873. 균주를 이용한 혼합배양과 담체를 이용한 혼합배양의 효율성 비교 874. 담체를 이용한 혼합배양시간에 따른 영향 88Ⅲ. 결 과 891. 담체 내 미생물 군집 형성 892. 미생물 담체를 이용한 고체배지에서의 항균활성 확인 893. 균주를 이용한 혼합배양과 담체를 이용한 혼합배양의 효율성 비교 934. 담체를 이용한 혼합배양시간에 따른 영향 93Ⅳ. 고찰 97참고문헌 99요약 115Abstract 117
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