아마란스는 국내·외에서 오래전부터 종자 및 엽채의 영양성분, 항산화, 항당뇨 효능 등 영양적 가치를 확인한 연구가 다수 진행되었기 때문에 곡물의 대체 작물로써 기대할 만한 가치가 있다. 해외에서는 이미 다양한 형태로 가공하여 섭취하고 있는 반면 국내에서는 아마란스 잎 덖음차 또는 종자를 잡곡처럼 첨가하여 먹는 형태로 판매되는 것이 대부분이며 제품의 다양성이 떨어지고 있다. 또한 발아 아마란스에 대한 기초자료는 부족한 실정이다. 당뇨병은 인슐린의 분비량이 부족하거나 정상적인 기능이 이루어지지 않는 등 대사성 질환의 한 종류로써 1형과 2형의 형태로 구분된다. 당뇨병으로 인해 고혈당의 상태가 오랜 기간 지속될 경우 심각한 당뇨원성 만성 합병증이 발생할 수 있고 심혈관계 질환의 위험 또한 높아질 수 있다. 당뇨병은 근본적으로 치료할 수 있는 방법이 개발되지 못하고 있고 운동 및 식사 요법과 함께 약물 요법을 적극적으로 활용하여 정상 수준의 혈당이 유지되도록 하는 것이 최선의 치료 방법으로 이용되고 있다. 따라서 최근에는 상대적으로 부작용이 적으며 혈당 조절 효과를 가진 천연 소재를 찾고자 하는 연구가 진행되고 있다. 혈당 조절 효과를 평가할 수 있는 지표는 당 가수분해 효소인 α-amylase, α-glucosidase 저해활성 및 세포 내의 glucose uptake 정도와 관련 유전자인 glucokinase, pyruvate dehydrogenase, acetyl-CoA carboxylase, glucose transporters, insulin receptor substrates의 mRNA 발현 정도 등이 있다. 따라서 본 연구는 아마란스 종자의 색과 발아 여부로 구분하여 일반성분을 분석하였고 80% ethanol을 이용해 추출물을 제조하였다. 총 폴리페놀, 총 플라보노이드, DPPH, ABTS 라디칼 소거활성을 통해 항산화 성분 및 활성을 측정하였고 α-amylase, α-glucosidase, glucose uptake와 관련 유전자인 ACC, GLUT-2, GLUT-4, IRS-1, IRS-2 발현량 변화정도를 측정하여 간세포 내에서 혈당 개선 및 조절 효과를 보고 연구의 기초자료가 되고자 하였다. HepG2 세포에서 모든 아마란스 종자 추출물을 1, 2, 5, 10, 20, 50, 100 μg/mL의 농도로 처리하여 세포생존율을 측정한 결과 50 μg/mL 이하의 농도에서는 독성이 없는 것을 확인하였다. 따라서 모든 세포 실험의 추출물 처리 농도는 1, 2, 5, 10, 20, 50 μg/mL 의 농도로 결정하였다. 1, 2, 5, 10, 20, 50 μg/mL 의 농도의 GBA를 처리한 HepG2 세포에서 ACC의 mRNA 발현량은 모든 농도에서 유의적으로 증가하였다. GLUT-2, GLUT-4의 mRNA 발현량은 농도의존적으로 증가하였으나 GLUT-2는 간세포에 많이 분포하고 있으며 인슐린과 관게없이 혈당을 세포 내로 유입시키기 때문에 GLUT-2가 GLUT-4 보다 발현량이 크게 증가하였다. 인슐린 신호 전달을 통해 혈중 포도당을 세포 내로 유입시켜 당 대사에 관여하는 IRS-1과 IRS-2는 농도 의존적으로 발현량이 증가하였으나 IRS-1이 주로 당 대사에 관여하고 IRS-2는 췌장 β-cell의 기능과 성장을 촉진하는 데 관여하기 때문에 IRS-1이 IRS-2보다 발현량이 더 증가한 것으로 사료된다. 당 분해 효소 저해율 및 Glucose uptake 실험 결과 발아 처리한 시료 또는 유색 시료에서 활성 정도가 높게 나타났다. 특히 흑색 발아 아마란스 시료는 활성 정도가 높게 나타나 glucose uptake 관련 유전자 mRNA 발현량 변화를 관찰한 실험을 진행한 결과 혈당 조절 효과를 나타내는 천연소재로 이용될 수 있는 가능성을 제시하였다.
Amaranth has been studied for a long time in Korea and abroad, and many studies have been conducted to identify nutritional value such as nutrients, antioxidant effects, and antidiabetic effects of seeds and leaf. Therefore it is worthy of being expected as an alternative crop for grain. While it is already processed and consumed in various forms overseas, it is mostly sold in the form of roasted leaf tea or grains, and the diversity of products is depreciated in Korea. There is a lack of basic data on germinated Amaranth seeds. Diabetes is a type of metabolic disease that occurs due to lack of insulin secretion or lack of normal function. It is classified into the 1 type and 2 type. If diabetes causes high blood glucose levels to persist for a long time, serious complications can occur and the risk of cardiovascular disease can increase. There is no fundamental way to treat diabetes. It is best to actively utilized drug therapy along with exercise and diet to maintain normal blood glucose. Therefore, research is being conducted to find natural materials with relatively few side effects and blood glucose control effects. The indexed that can evaluated the effect of blood glucose control are α-amylase, α-glucosidase inhibitory activity, glucose uptake in cells and related genes such as mRNA expressions of glucokinase, pyruvate dehydrogenase, acetyl-CoA carboxylase, glucose transporters, insulin receptor substrates etc. Therefore, this study analyzed proximate composition by dividing the color and germination of Amaranth seeds. The extracts was using 80% ethanol. Antioxidant components and activities were measured by total polyphenol, total flavonoid, DPPH and ABTS radical scavenging. α-amylase, α-glucosidase inhibition activity, glucose uptake in HepG2 cell, ACC, GLUT-2, GLUT-4, IRS-1, IRS-2 mRNA expression were measured to observe the effects of blood glucose improvement and regulation in hepatocytes and to be the basic data of related research. In HepG2 cells, all Amaranth seed extracts were treated with 1, 2, 5, 10, 20, 50, 100 μg/mL concentrations to measure cell viability. As a result, there was no toxicity at concentrations below 50 μg/mL. Therefore, the concentration of extract treatment in all cell experiments was determined by concentrations of 1, 2, 5, 10, 20, 50 μg/mL. The mRNA expression of ACC in GBA-treated HepG2 cells was significantly increased in all concentrations. The mRNA expression of GLUT-2 and GLUT-4 was increased concentration-dependently. GLUT-2 is distributed in hepatocytes and its expression level is significantly increased compared to GLUT-4 because it enters blood glucose into cells regardless of insulin. IRS-1 and IRS-2 are involved in metabolism by allowing blood glucose to enter the cell through insulin signalling. IRS-1 and IRS-2 were increased in concentration-dependent expression. IRS-1 is mainly involved in glucose metabolism. IRS-2 is involved in the function and growth of pancreatic beta cells, which suggests that IRS-1 is more expressed than IRS-2. Glucose hydrolytic enzyme inhibitory rate and glucose uptake assay results showed that the activity level was high in germinated or colored samples. Especially, the germinated black Amaranth sample showed high activity. Therefore, I observed changes in the expression of glucose uptake-related gene mRNA, and the results of the experiment suggested the possibility of being used as a natural material that shows blood glucose control effect.
목차
Ⅰ. 서 론 1Ⅱ. 재료 및 방법 81. 실험재료 8가. 아마란스 발아 및 추출물 제조 8나. 시약 및 기구 9다. 세포주 및 세포배양 102. 실험방법 11가. 발아 및 색에 따른 아마란스 종자의 일반성분분석 11나. 발아 및 색에 따른 아마란스 종자 추출물의 항산화 성분 및 활성 12(1) 총 폴리페놀 함량 12(2) 총 플라보노이드 함량 13(3) DPPH 라디칼 소거 활성 14(4) ABTS 라디칼 소거 활성 15다. 발아 및 색에 따른 아마란스 종자 추출물의 혈당 조절 효과 16(1) α-Amylase 저해 활성 16(2) α-Glucosidase 저해 활성 17(3) HepG2 세포 생존율 18(4) Glucose uptake 19(5) RNA 추출 및 cDNA 합성 20(6) 당대사 효소 및 Glucose uptake 관련 유전자 발현 RT-PCR 21라. 통계처리 24Ⅲ. 결과 및 고찰 251. 발아 및 색에 따른 아마란스 종자의 일반성분 25가. 일반성분 25나. 추출수율 282. 발아 및 색에 따른 아마란스 종자 추출물의 항산화 성분 및 활성 30가. 총 폴리페놀 함량 30나. 총 플라보노이드 함량 32다. DPPH 라디칼 소거 활성 34라. ABTS 라디칼 소거 활성 363. 발아 및 색에 따른 아마란스 종자 추출물의 혈당 조절 효과 38가. α-Amylase 저해 활성 38나. α-Glucosidase 저해 활성 40다. HepG2 세포 생존율 42라. Glucose uptake 44마. 당 대사 효소 및 Glucose uptake 관련 mRNA 발현 RT-PCR 46(1) Acetyl-CoA carboxylase mRNA 발현 46(2) Glucose transporter-2(GLUT-2) mRNA 발현 48(3) Glucose transporter-4(GLUT-4) mRNA 발현 50(4) Insulin receptor substrate-1(IRS-1) mRNA 발현 52(5) Insulin receptor substrate-2(IRS-2) mRNA 발현 54Ⅳ. 요약 및 결론 56