Cyclophosphamide로 면역 저하시킨 C57BL/6 마우스에서 양파 껍질 열수 추출물의 항산화 및 면역 증진 효과 :Antioxidant and Immune Stimulating Effects of Hot Water Extract from Allium cepa skin in the C57BL/6 Mouse Immunosuppressed by Cyclophosphamide

김지수

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자료유형: 학위논문

저자정보: 김지수 (전북대학교, 전북대학교 일반대학원)

지도교수: 차연수

발행연도: 2023

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이 논문의 연구 히스토리 (5)

2023

Cyclophosphamide로 면역 저하시킨 C57BL/6 마우스에서 양파 껍질 열수 추출물의 항산화 및 면역 증진 효과

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양파(Allium cepa L.)는 심장병 예방, 항균, 항암과 같이 다양한 질병 예방 및 건강 개선에 효과가 있는 것으로 밝혀졌다. 2020년 한국의 양파 1인당 1일 소비량은 31.75 g이고 2022년 한국의 양파 생산량은 1,195,563 톤이었다. 양파 과육은 식품 재료로 사용되지만 껍질은 농식품 부산물로 버려지며 이는 환경 오염에 영향을 줄 수 있다. 따라서 이번 연구에서는 양파 껍질을 이용해 RAW 264.7 세포와 cyclophosphamide(CPA)로 유도된 면역 저하 모델에서 항산화 및 면역 증진 효과를 평가하였다.
그 결과, 퀘르세틴, 안토시아닌, 총 플라보노이드 및 총 폴리페놀 함량은 양파 껍질 열수 동결건조물을 만드는 과정 동안(양파 껍질 액체 추출물 < 양파 껍질 액체 여과물 < 양파 껍질 농축물 < 양파 껍질 동결건조물) 증가하였다. 양파 껍질은 DPPH, ABTS 라디컬 소거능과 xanthine oxidase inhibitory에서 높은 활성을 보였고 이들의 IC50은 각각 954.9 μg/mL, 28.0 μg/mL, 10.7 μg/mL 이었다. RAW 264.7 세포 배양 상층액에서 측정한 superoxide dismutase(SOD)와 catalase(CAT) 활성은 양파 껍질이 media control보다 높았다. RAW 264.7 세포에서 OS의 독성은 나타나지 않았으며 산화질소와 사이토카인(IL-1β, IL-6, IFN-γ와 TNF-α)의 함량은 농도 의존적으로 증가하였다. 그리고 이러한 OS의 면역증진 효과는 MAPK 신호전달경로 및 NF-κB 활성화를 통해 이루어지고 있음을 확인하였다. CPA로 면역 저하시킨 마우스의 혈청에서 OS의 항산화 효과를 평가하였을 때, OS100(OS 100mg/kg body weight), OS200(OS 200mg/kg body weight)의 SOD 수준은 normal control(NOR)과 비슷한 수준으로 나타났다. 비장 세포에서의 B 세포 증식은 OS100과 OS200에서 negative control(NC)에 비해 높았고(p < 0.05), NK 세포 활성도 OS를 투여한 군에서 NC군보다 증가하였다. 또한 백혈구 수, 혈청 사이토카인(IL-1β와 IFN-γ) 및 IgG는 OS100과 OS200에서 정상군 수준으로 회복되었다. 따라서, 양파 껍질 추출물은 항산화 효과와 면역 증진 효과를 가지고 있으며 향후 새로운 기능성 농식품 소재가 될 수 있을 것으로 보인다. 또한 양파 껍질의 업사이클링은 탄소 중립과 자원 순환 등을 통해 환경 보호에도 기여할 것으로 기대된다.

Allium cepa L. (onion) has been reported with various healthy effects such as preventing heart disease, antimicrobial activity, and anticancer effects. The daily intake of onion per person was 31.75g in Korea (2020) and the production was 1,195,563 tons in Korea (2022). The flesh was used but the onion skin (OS) is considered waste and it can cause environment pollution. So, using the OS as functional food material, could help protecting the environment. Therefore, this study evaluated the antioxidant and immune-enhancing effects of OS in RAW 264.7 cell and the immunosuppressed mice by cyclophosphamide (CPA).
The concentrations of quercetin, anthocyanin, total flavonoids, and total phenol increased during the OS processing (Liquid extract of OS < Filtered liquid < Concentrated liquid < Dried OS). OS showed high 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH)-, 2.2’-Azino-bis(3-ethylbenzo thiazoline-6-sulfonic acid) ABTS-radical scavenging activity, and xanthine oxidase inhibitory activity and the antioxidant activities dose-dependently increased. IC50 of DPPH-, ABTS-radical scavenging activities, and xanthine oxidase inhibitory activity were 954.9 μg/mL, 28.0 μg/mL, and 10.7 μg/mL, respectively. Superoxide dismutase (SOD) and catalase (CAT) activities of OS in the cell supernatant were higher compared to the media control. There was no cytotoxicity of OS in RAW 264.7 cell. NO and cytokines (IL-1β, IL-6, IFN-γ, and TNF-α) produced by OS in RAW 264.7 cell significantly increased in a dose dependent manner. Also, OS increased MAPK and NF-κB signaling in RAW 264.7 cells. Antioxidant and immune-enhancing effects of OS in immuno-deppressed mice by CPA were evaluated. SOD levels of serum and B cell proliferation in splenocytes were higher in OS200 than OS100. WBC counts, serum cytokines (IL-1β and IFN-γ) and IgG levels and NK cell activity were higher in OS groups compared to the NC group. These results suggest that OS has antioxidant ability and can enhance immunity by affecting the immune system. Also, upcycling of OS may contribute to reduce environmental pollution.

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1. INTRODUCTION 1
1.1. Antioxidant 1
1.2. Immunity 3
1.3. Cyclophosphamide 5
1.4. Allium cepa L. skin 7
1.5. Objectives of this study 10
2. MATERIALS AND METHODS 11
Chapter1. Measurement of functional components and antioxidant effects 11
1.1.Plant material and sample preparation 11
1.2. Analysis of functional components 13
1.2.1. Quercetin 13
1.2.2. Anthocyanin 14
1.2.3. Total flavonoids 15
1.2.4. Total polyphenols 16
1.3. Antioxidant activities 17
1.3.1. Antioxidant activities of A. cepa skin 17
1.3.1.1. 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl radical scavenging activity 17
1.3.1.2. 2.2''-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) radical scavenging activity 18
1.3.1.3. Xanthine oxidase inhibition activity 19
1.3.2. Antioxidant activities in cell supernatant 20
1.3.2.1. Superoxide dismutase activity 20
1.3.2.2. Catalase activity 21
Chapter 2. Measurement of immune-stimulating effects in RAW 264.7 cell 22
2.1. Cell viability 22
2.1.1. MTS assay 22
2.1.2. WST assay 23
2.2. NO assay 24
2.3. Cytokines 25
2.3.1. ELISA assay 25
2.3.2. RT-PCR assay 26
2.4. Western blot analysis 27
Chapter 3. Measurement of antioxidant and immune-stimulating effects in immunosuppressed mice 28
3.1. Experimental animals 28
3.2. Antioxidant activity in serum 32
3.3. Hematological analysis 33
3.4. Splenocyte proliferation 34
3.5. ELISA assay 35
3.6. NK cell activity 36
3.7. Statistical analysis 37
3. RESULTS 38
Chapter 1. Functional components and antioxidant effects 38
1.1. Functional components of A. cepa skin 38
1.2. Antioxidant activities of A. cepa skin 40
1.3. Antioxidant activities of A. cepa skin in RAW 264.7 cell supernatant 44
Chapter 2. Immune-stimulating effects in RAW 264.7 cell 46
2.1. Effects of A. cepa skin on RAW 264.7 cell viability 46
2.2. Effects of A. cepa skin on NO production of RAW 264.7 cell 48
2.3. Effects of A. cepa skin on cytokines of RAW 264.7 cell 50
2.4. Effects of A. cepa skin on MAPK and NF-κB pathway in RAW 264.7 cells 53
Chapter 3. Antioxidant and immune-stimulating effects in immunosuppressed mice 56
3.1. Effects of A. cepa skin on serum antioxidant activity 56
3.2. Effects of A. cepa skin on the proliferation of splenocyte treated with mitogens 58
3.3. Effects of A. cepa skin on hematological factors 60
3.4. Effects of A. cepa skin on serum cytokines and IgG 62
3.5. Effects of A. cepa skin on NK cell activity 64
4. DISCUSSION 66
5. CONCLUSIONS 73
6. REFERENCES 74
ABSTRACT (Kor) 84

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