Protease inhibitor (단백질분해효소 저해제)는 수산 및 축산 식품의 품질에 바람직하지 못한 영향을 주는 단백질분해효소의 촉매작용을 저해하는 단백질이나 peptides 등을 말한다. 이와 같은 protease inhibitor는 일반적으로 강장동물, 인간의 혈청, 동물, 식물, 박테리아에 널리 분포하고 있고 의약품, 농업, 생물공학 분야에 널리 이용되고 있다. 또한 생물체내에서 혈액응고, complement activation, 세포 이동, 호르몬 운반, 종양 억제, pro-hormone 전환, fibrinolysis, 감염성 반응 등 생리적으로 중요한 역할을 한다.
식품산업에서 protease inhibitor를 이용한 대표적인 연구로는 수산 및 축산 식품의 선도유지, 조직감 개선 및 고 활성 protease를 함유하는 어육의 surimi 소재로서의 응용 등이 있다.
한편, 시판 food-grade protease inhibitor에는 egg white powder, whey protein concentrate, beef plasma protein, potato extract가 사용되고 있으며, 이들 protease inhibitor의 효과는 원료 어종에 따라 surimi의 품질에 차이가 있어, egg white powder와 beef plasma protein이 주로 사용되고 있다. 그러나 현재 축산식품 소재는 광우병, 조류 독감 등에 노출되어 건강을 우려하는 소비자에게 외면을 받고 있어, 조류독감 및 광우병의 위험성이 없는 수산동물의 가공부산물 소재로부터 food grade용 protease inhibitor의 개발이 요구된다.
수산가공부산물로서 명태 알, 대구 알, 청어 알, 날치 알 및 철갑상어 알 등과 같은 몇몇 종류의 어류 알이 수산식품 및 식재료로 이용될 뿐, 대부분의 어류 알은 아무런 용도 없이 폐기되고 있다. 수산물 가공 중 발생하는 알의 양이 많은 어종 중의 하나인 황다랑어의 알은 전 어체 중량의 1.5-3.0%를 차지하며, 식용소재로서 효율적으로 이용되지 못하고 가축 및 애완동물의 사료로 이용되거나 대부분 폐기되고 있는 실정이다.
선행 연구를 통해 8종의 어류 알에서 protease inhibitor의 분포가 확인되었으며, 어류 알 추출물로부터 protease inhibitor의 단백질 용해도차이에 의한 분획 및 단백질의 분자량과 하전의 차이에 근거한 크로마토그래피에 의한 분획을 통하여 protease inhibitor의 효율적 분획방법에 대해 검토 한 바 있다. 최적의 분획 공정의 확립 및 개발을 위해서는 대량처리 및 분획이 가능한 ammonium sulfate의 장점과 단백질 분자량의 크기에 따라 분획과 연속처리가 가능한 gel filtration의 장점을 동시에 충족시키면서 단백질 변성을 최소화하는 단시간내에 처리 가능한 분획 방법이 요구되었다. 이에 이상의 장점을 충족하는 방법으로써 ultrafiltration (UF) system을 통한 분획공정 개발을 확립하고자 하였다.
UF 공정은 높은 생산성과 정제도를 얻을 수 있으며, 비용효율이 높고 크로마토그래피나 전기영동과 비교해서 대량으로 처리하기 쉽다. 최근에 UF공정은 난백의 lysozyme, 수리미 세척수로부터 얻은 protease, potato fruit juice의 단백질, 어류 내장으로부터 얻어지는 protease와 단백질 가수분해물, 닭 혈장 단백질과 같은 화합물들의 분리에 널리 사용되고 있다.
본 연구에서는 우리나라에서 기호도가 높고, 횟감 및 통조림으로 소비량이 많은 어종으로, 가공부산물이 대량 발생하는 황다랑어 알의 crude extract (CE)로부터 효율적으로 protease inhibitor를 얻기 위해 100 K, 30 K, 그리고 10 K 분획분자량(membrane weight cut-off, MWCO)을 가지는 세 가지 막을 사용하여 UF system을 통한 네 가지 공정개발과정을 거쳤으며, 최종공정으로부터 분획된 protease inhibitor 획분으로 분말과 액상저해제를 제조하여 저장기간 동안의 안정성을 살펴보고자 하였다. 또한 CE로부터 60-80% 포화농도로 ammonium sulfate 침전을 통해 얻어진 획분으로부터 단백질의 하전 (net charge)과 단백질의 분자량 (size exclusion)의 차이에 근거한 ion exchange chromatography와 gel filtration을 통하여 serine protease inhibitor (YTSPI)를 정제하고 정제된 inhibitor의 특성에 대해 밝히고자 하였다.
첫 번째 공정에서는 30 K MWCO와 10 K MWCO을 가지는 막을 연속적으로 사용하여 30 RT, 30-10 FR, 10 PM의 3가지 획분을 얻었다. 획분들 중에는 30 RT에서 가장 높은 단백질함량 (2,613 mg)이 회수되었고, BAPNA를 기질로 사용하였을 때 trypsin에 대해 가장 높은 specific inhibitory activity (SIA, U/mg)와 recovery (%)를 나타내었다.
두 번째 공정은 100 K MWCO 막을 추가하여 100, 30, 10 K MWCO을 가지는 3개의 막을 통해 개별적으로 분획하여 6개의 획분 (100 RT, 100 PM, 30 RT, 30 PM, 10 RT, 10 PM)을 얻었다. 막 크기에 상관없이 retentate fraction (1,729-1,915 mg)이 permeate fraction (1,085-1,292 mg)보다 높은 단백질 함량을 나타내었다. Casein을 기질로 사용하였을 때 SIA (U/mg) 값은 효소들 중 chymotrypsin에서 가장 높았으며 이때의 recovery는 retentate fraction들에서 높았다 (82-99%). 전기영동 상에서는 막 크기에 따른 retentate fraction들 간의 차이가 없었다.
세 번째 공정에서는 정제도와 저해활성을 높이기 위해 0-40, 40-80% ammonium sulfate (AS) 침전을 통한 분획과정을 추가하여 10 K 막으로부터 UF를 통한 탈염처리를 하였고, 이어서 40-80% AS fraction으로부터 10, 30, 100 K 막을 연속적으로 사용하여 4개의 획분 (10 PM, 10-30 FR, 30-100 FR, 100 RT)을 분획하였다. 이들 4개의 획분들 중 100 RT (1,960 mg)에 95%의 단백질이 회수되었고 trypsin과 chymotrypsin에 대한 저해활성과 recovery 또한 100 RT에서 가장 높았다.
최종공정에서는 AS 분획을 통하여 얻은 40-80% AS fraction을 투석막 (10 K MWCO)을 이용하여 탈염과정을 거친 다음, 100 K 막만을 사용해서 2개의 획분 (100 RT 및 100 PM)을 분획하였다. Casein과 BAPNA를 기질로 사용하였을 때 trypsin에 대한 recovery는 획분들 중 100 RT에서 높게 나타났다. 또한 100 RT는 사용된 11종의 효소 중 trypsin (18.3%)과 chymotrypsin (35.1%)에 높은 relative inhibitory activity (RIA, %)를 나타내어 serine protease inhibitor (SPI)로 판단되었다. SPI fraction은 pH 3-5범위에서 90%이상의 저해활성을 유지하였고, 20-40℃에서 100% 이상의 저해활성을 나타내었으며, 45℃ 이상의 온도에서는 저해활성이 급격하게 감소하였다. SPI fraction은 합성기질인 BAPNA와 SAAPFPNA를 사용하였을 때 trypsin과 chymotrypsin에 대해 각각 linear mixed type의 경쟁적 저해와 linear mixed type의 비경쟁적 저해를 보였다.
100 RT로부터 제조된 분말과 액상저해제의 백색도는 각각 87.99와 39.80이었다. 저해제를 제조하기 전의 pH는 5.96이었으며, 분말 및 액상 저해제의 pH는 각각 5.39 및 5.06이었다. 제조된 저해제의 저해활성은 trypsin보다 chymotrypsin에 대한 저해활성이 높았고, 저장안정성은 분말저해제가 액상저해제보다 높았다.
황다랑어 알로부터 protease inhibitor의 정제는 60-80% AS fraction으로부터 Toyopearl SP-650S column (2.6 × 30 cm), DEAE Toyopearl 650 M column (2.6 cm x 20 cm), Sephacryl S-300 column (1.6 cm x 100 cm), DEAE Toyopearl 650 M column (1.6 × 20 cm)을 연속적으로 거쳐 BAPNA 기질을 사용하여 trypsin에 대한 저해활성을 보인 획분을 분획하여 최종적으로 YTSPI (serine protease inhibitor purified from yellowfin tuna roe)를 정제하였다. Trypsin에 대한 60-80% AS fraction의 IC50값은 1.039 mg/mL이었고 YTSPI의 IC50값은 0.015 mg/mL로 감소하여 정제 후 저해활성이 증가하였음을 확인하였다. 시판 protease inhibitor인 egg white는 trypsin에 대해 100 μg/mL의 농도에서 5.2%의 저해를 보였고, YTSPI는 13.0 μg/mL의 농도에서 43.1%의 저해활성을 나타내어 YTSPI는 egg white보다 높은 저해활성을 가지는 것으로 확인되었다. YTSPI는 BAPNA와 SAAPFPNA를 기질로 사용한 경우 trypsin과 chymotrypsin에 대해 linear mixed type의 비경쟁적 저해를 나타내었고, trypsin과 chymotrypsin에 대한 저해상수 (Ki) 값은 각각 14.70 μg/mL와 0.27 μg/mL이었다.
이상의 결과로부터 황다랑어 알로부터 UF 공정을 통해 얻어진 protease inhibitor는 시판 egg white에 비해 serine protease에 대한 저해활성이 월등히 높아 산업적 응용가능성이 높은 것으로 판단되었다. 향후 연구로는 황다랑어 알에서 분획한 protease inhibitor를 내인성효소를 함유하고 있는 어종으로 제조한 surimi에 적용하여 자가소화 저해효과에 대한 검토가 필요하며, UF과정 중 막 표면에 입자들이 축적되는 문제를 개선하기 위한 효율적인 방법으로 알 추출물을 분획하기 전 알 추출물에 소량의 염을 첨가하여 분획하는 방안에 대해서도 검토가 이루어져야 할 것으로 사료된다.